MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при образовании зоны локальная концентрация белка может оказаться значительной. Поэтому приходится использовать буферы с концентрацией 0,1?—?0,2 М и более. При этом следует учитывать, насколько близко к границе буферной области лежит рабочее значение рН. Если такое приближение к границе необходимо, то для обеспечения достаточной буферной емкости молярность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электропроводности буферов рассмотрен ниже.

Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости белковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агрегации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упаковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эффект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеиновых кислот.

Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей жесткость. Именно такой прием используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно это будет рассмотрено ниже).

Напряженность электрического поля (н)

Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка геля длиной l Е?=?Нl. В проводящей ток жидкости приложенному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, которая в соответствии с законом Ома определяется суммарным сопротивлением цепи R (I=E/R). В ПААГ проводящей жидкостью служит буфер, находящийся между нитями полимера. Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заряженные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим вкладом можно пренебрегать.

Электрическое сопротивление буфера определяется двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Второй фактор играет очень важную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух буферах ионов С1– и СН3СОО– электропроводность первого буфера будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о том, что электрический ток одинаков по всей длине электрической цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разрывов или скачков тока по длине геля физически быть не может, это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряженностью электрического поля.

Если в любой электрической цепи последовательно включены два различных по своей величине сопротивления R1 и R2, то одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них за счет падения на нем напряжения Е1=IR1, а через второе — за счет Е2=IR2. Полное напряжение по всей электрической цепи Е=Е1+Е2. Если R1 сильно отличается от R2, то и Е1 также отличается от E2. При изменении сопротивлений двух участков распределение напряжений на них может существенно измениться, оставаясь в сумме своей неизменным.

Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух последовательно расположенных участков, где при полимеризации были использованы разные буферы (содержащие ионы с разной подвижностью или просто различающиеся по концентрации). Сопротивления этих участков могут оказаться разными: следовательно, различными могут быть и падения напряжения на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значения напряженности поля на двух участках. Действительно, падение напряжения на участке пропорционально его сопротивлению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому соотношение напряженностей поля на двух участках геля не зависит от их длины и определяется только концентрациями и подвижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию можно себе представить в двух простейших вариантах.

Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно, ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентрация буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому, что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В. Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля, и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое сечение обоих участков, а также через границу между ними, будет одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что количество ионов в A не истощается — оно пополняется за счет ионов, поступающих из электродного буфера.

Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обоих участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются намного меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет о подвижности в свободной жидкости (u0), так как сетка геля не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH), а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обусловливает большую величину сопротивления. Суммарное напряжение распределится между участками A и B так, что напряженность поля в A будет соответственно выше, причем именно настолько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорциональная произведению подвижности на напряженность поля, стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует условие неизменности величины тока вдоль всего геля.

В более сложных случаях могут различаться как подвижности ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряженности электрического поля в двух последовательно расположенных участках геля устанавливаются такими, что они компенсируют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень разными. Очень важно, что это различие существенным образом влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На "ом участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рассмотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белкоых зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в однородном по напряженности электрическом поле, чтобы разделение белков отражало истинное различие их собственных характеристик — молекулярных масс и электрического заряда.

Выбор буфера рабочего геля

Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что сама по себе величина рН практически не сказывается на электропроводности геля. Даже при рН 4 концентрации протонов (0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и к ионам ОН– в реально используемом диапазоне рН щелочных буферов.

В то же время косвенным образом выбор рН может сильно влиять на электропроводность данного буфера, определяя степень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый Трис-НСl-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис+, С1– и незаряженные молекулы Триса. Для этого буфера рKa?=?8,1. Это означает, что при рН 8,1 ровно половина молекул Триса несет положительный заряд, практически целиком за счет протонов соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в растворе находится такое же количество ионов С1–. Таким образом, при рН?8,1 0,1?М Трис-НСl содержит 0,05 М Трис+ и 0,05 М С1–. Электропроводность этого буфера будет определяться, в основном, ионами С1–, так как их подвижность намного выше, чем у тяжелых ионов Трис+. 0,05?М С1– обеспечивает достаточно высокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же концентрации и рН имеет значительно меньшую электропроводность, так как подвижность аниона СН3СОО– явно ниже, чем С1–.

При рН 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-НСl увеличится примерно вдвое, так как этот рН лежит вблизи границы буферной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизированы; следовательно, концентрация С1– составит около 0,1 М. Наоборот, при рН 8,9 электропроводность этого буфера значительно ниже, чем при рН 8,1, так как для титрования до рН 8,9 потребуется заметно меньше НС1.

Существенную роль в определении электропроводности играет выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко понять, что К- или Nа-фосфатные буферы, как и Трис-НСl, отличаются высокой электропроводностью за счет ионов К+ и Nа+. То же относится к К- или Nа-ацетатным буферам. Между тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концентрации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фосфатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отличается меньшей электропроводностью. Относительно низкую электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что электропроводности буферных систем, в которых не участвуют легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щелочей, относительно невелики. Это важное заключение будет играть существенную роль в дальнейшем изложении. К сожалению, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.

Таким образом, электропроводность рабочего буфера определяется тремя факторами: концентрацией, необходимой для поддержания нужного рН в белковых зонах, степенью диссоциации буферных веществ при этом рН и характером участвующих в диссоциации ионов.

Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутствующую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, следует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра цию до 0,05 М. На избыток соли в препарате указывает, между прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя граница полосы препарата сразу после его вступления в гель. При нормальном разделении должна иметь место как раз обратная картина — резкая передняя и более диффузная задняя граница полосы. Это можно проконтролировать путем окрашивания пробного геля через 20?—?30 мин после начала электрофореза или при использовании люминесцентных маркеров (см. ниже).

Помимо суммарной электропроводности, определенную роль играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигрирующих в том же направлении, что и разделяемые макромолекулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей подвижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы большие органические ионы: Трис+ (катион), остатки барбитуровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании щелочных белков, а барбитуратный — для кислых белков вблизи нейтральной области рН буфера.

Выделение тепла при электрофорезе

Высокая электропроводность буфера нежелательна, поскольку ограничивает возможность повышения напряженности электрического поля в геле из-за увеличения тока и связанного с этим выделения тепла. Между тем, именно напряженность поля обеспечивает всегда желательное ускорение миграции белков.

Электрическая мощность, рассеиваемая в виде тепла в геле, равна произведению силы тока на падение напряжения по длине геля (IЕ). В главе 1 было отмечено, что разумной продолжительности электрофореза соответствует напряженность поля 10?—?20 В/см. Кстати, как показывает практика, при заметном превышении этих значений качество полос в обычных условиях охлаждения ухудшается. Для геля длиной 20 см такой напряженности соответствует напряжение 200?—?400 В. При воздушном охлаждении вертикально расположенных пластин эффективный теплоотвод возможен при рассеиваемой мощности не более 20 Вт, что соответствует силе тока 50?—?100 мА на пластину. В приборе GЕ-2/4 фирмы «Рhаrmасiа» (рис. 15) с принудительным жидкостным охлаждением пластин уровень мощности может быть увеличен до 100 Вт с соответствующим повышением напряженности поля и ускорением фракционирования белков. Приборы для электрофореза в горизонтальных пластинах успешно осуществляют теплоотвод при мощности до 40 Вт.

В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого является замена более подвижных ионов буфера в геле на менее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе.

Рис. 15. Прибор для электрофореза в вертикальных пластинах с циркуляцией буфера (Тип GЕ-2/4 фирмы «Рharmacia») Как уже отмечалось, для сокращения продолжительности разделения и уменьшения диффузии зон электрофорез желательно вести при максимальном напряжении. Его начальное значение ограничивается требуемой вначале силой тока и максимально допустимой для данного прибора мощностью. По мере роста сопротивления в геле сила тока снижается, и напряжение можно увеличивать. Современные источники напряжения делают это автоматически, поддерживая заданный постоянный уровень мощности, рассеиваемой в геле. От опасного (с точки зрения надежности изоляции) повышения напряжения при этом можно застраховаться, ограничив максимально допустимую его величину. Достигнув ее, прибор переключается на режим поддержания постоянного напряжения, поэтому при дальнейшем возрастании сопротивления сила тока и расходуемая в геле мощность начинают снижаться.

В некоторых случаях сопротивление всей цепи электрофореза может и уменьшаться. В частности, это может происходить как из-за нагревания геля (напомним, что подвижность ионов с температурой возрастает), так и за счет накопления ионов в электродных резервуарах. В этих случаях источник тока, отрегулированный на постоянную мощность, автоматически снижает напряжение, а максимально допустимая сила тока может быть заранее ограничена. Такого типа источники («Соnstant роwеr suрр1у») выпускаются фирмами «Рharmaciа» (модель ЕСРS 3000/150) и LКВ (модель 2103). В других типах источни ков (ЕРS 500/400 фирмы «Рharmaciа» и модель 500 фирмы «Вio-Rad») можно заранее установить постоянные значения напряжения или тока и задать величину максимально допустимой мощности, по достижении которой соответственно напряжение или ток начинают автоматически уменьшаться.

Загрузка геля. Ширина белковых зон

Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофорезе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон (полос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от состава белковой смеси и характера разделения полос. В качестве ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка 1 мг суммарного препарата белка на 1 см2 сечения геля. Для кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответствует примерно 75 мкг белка, а для трубки диаметром 6 мм — до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке белковые полосы бывают резкими в передней своей части и размытыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью преципитации белка в момент вступления его в гель, когда все макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная концентрация их сильно увеличивается.

Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких зон. Ограничения в этом случае накладываются только методами обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет во времени, всегда желательно сокращение продолжительности электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вызывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос. Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следовательно, увеличивается продолжительность электрофореза.

В простом варианте электрофореза желательно наносить белковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота исходного слоя препарата была не более 2?—?3 мм. Выполнить это условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной концентрации исходного препарата. На основании приведенных выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препарате должна составлять 3?—?5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти эту трудность; они направлены на концентрирование белкового препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель. Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем область с повышенной напряженностью поля, где белки мигрируют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4?— 30% ПААГ) а — начало фракционирования белков сыворотки; б — тот же гель после 60 ч диффузии при комнатной температуре и выключенном напряжении; в — через 6 ч после возобновления электрофореза молекулы белка «догонят» впереди идущие молекулы, замедлившие свое движение при вступлении в рабочий гель.

Область с повышенной напряженностью поля можно создать в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малоподвижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход использован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5?—?10 раз менее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое применение в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого приема.

Другой очень эффективный способ сужения полос — использование градиента пористого геля. В этом случае при миграции вдоль геля передний край каждой полосы все время оказывается в области чуть более концентрированного геля, чем задний. Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю полосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продвижения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстрировали специалисты фирмы «Рharmaciа» на выпускаемых этой фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации ПААГ (4?—?30%). Начав электрофоретическое фракционирование белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диффузия полностью размывала сформировавшиеся было белковые полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза удавалось получить четкую картину полос, содержащую все обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).

Введение мочевины и ?-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты

Высокая концентрация белков в зонах может привести к их осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: димерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, которые могут давать дополнительные полосы. Агрегация происходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвращения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концентрации 4?—?8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возможность частичного разложения мочевины с образованием циановой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно относится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появилась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исходный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозрительная полоса. Для предварительной деионизации маточный раствор мочевины (10?М) суспендируют с бифункциональной ионообменной смолой (например, AG 501???8) в соотношении 5 г смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной температуре.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru