Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

Отмечено также, что некоторые, особенно высокомолекулярные, белки после первоначального полного их восстановления обработкой ?-меркаптоэтанолом и ДДС-Na в ходе электрофореза снова частично окисляются с образованием дисульфидных мостиков между полипептидными цепями, что приводит к размыванию полос и невоспроизводимости результатов разделения. Рекомендуется восстановленное состояние белкового препарата закреплять путем его алкилирования по SH-группам обработкой йодацетамидом. Для этого исходный препарат инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количеству внесенного для восстановления белка ?-меркаптоэтанола при 50° в течение 15 мин. От избытка йодацетамида и побочных продуктов реакции можно не избавляться, а наносить всю инкубационную смесь прямо на гель [Lane, 1978].

Ступенчатый электрофорез в сочетании с обработкой ДДСNa успешно используется для пептидного анализа и сопоставления белков по пептидному составу. В 1977 г. группа авторов с участием Лэммли предложила для этой цели систему двумерного электрофореза, в которой ферментативный гидролиз белков проводят без их элюции, непосредственно в геле, после чего ведут электрофорез во втором направлении, позволяющий сопоставлять пептиды [Cleveland et al., 1977]. В первом направлении используют описанную выше систему Лэммли для разделения смеси сопоставляемых белков. После кратковременной окраски с целью обнаружения полос индивидуальных белков последние вырезают и вымачийают в буфере формирующего геля. Затем их помещают в карманы пластины геля второго направления, добавляют туда по 10 мкл того же буфера, но содержащего 20% глицерина, а потом наслаивают еще по 10 мкл буфера, но с 10% глицерина, в котором растворена сооответствующая протеаза. Во втором геле снова сформирована система ступенчатого электрофореза по Лэммли. Включают напряжение, а когда бромфеноловый синий приблизится к границе рабочего геля, напряжение на 30 мин отключают. За это время протеаза, которая тоже перешла в формирующий гель, гидролизует белок непосредственно в нем. В присутствии ДДС-Na протеолиз проходит не полностью, но в определенных условиях воспроизводимо. В ходе дальнейшего электрофореза пептиды разделяются и могут быть сопоставлены в параллельных треках пластины.

Без существенных изменений этот подход был использован и другими авторами [Przybyla et al., 1979; Gadasi et al., 1979]. В аналогичной работе (Bordier, Crettol-Jarvinen, 1979] в первом направлении использовали систему Лэммли в сочетании с градиентом пористости рабочего геля в пластине—концентрация ПААГ изменялась от 5 до 17,5%. При внесении в карманы геля второго направления полоски индивидуальных белков, вырезанные из пластины первого направления, заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы, чтобы фиксировать их исходное положение на дне кармана. В другой недавней работе [Nikodem, Fresco, 1979] белки гидролизовали бромистым цианом. Как и в предыдущей работе, в первом направлении белки фракционировали ступенчатым электрофорезом с обработкой ДДС-Na в градиенте пористости геля, вырезали слегка окрашенные полоски белков и обрабатывали их BrCN прямо в геле. Реакцию вели в маленьких пластмассовых флаконах под тягой. Затем полоски геля вымачивали в буфере и переносили в карманы пластины второго направления для разделения пептидов. Другие авторы [Boulikas et al., 1980] аналогичным образом проводили промежуточный гидролиз белков в геле N-бромсукцинимидом. В первом направлении белки разделяли электрофорезом в «кислой мочевине».

Особенно совершенной оказалась двумерная система фракционирования белков и пептидов, предложенная 0'Фаррелом [O'Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также использована методика Лэммли в сочетании с градиентом пористости ПААГ. Подробный разбор системы 0'Фаррела и ее модификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направлении в ней используется не электрофорез, а электрофокусирование.

Градиент пористости пааг

В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь рассмотрим возможности этого метода подробнее.

Техника приготовлений гелей с изменяющимися вдоль направления миграции белков размерами пор, или, как их называют, «градиентов пористости ПААГ», была подробно описана в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль градиента достигается путем увеличения концентрации акриламида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет целый ряд существенных преимуществ.

Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их может практически прекратиться. Для разных зон этот момент наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны мигрируют до своего конечного положения, соответствующего их размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положения, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для белков разной величины конечные положения окажутся в разных участках градиента пористости. К моменту окончания процесса фракционирования в целом все белковые зоны займут свои стационарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет включено электрическое напряжение. Таким образом, экспериментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза. Его продолжительность можно выбрать «с запасом», например поставить опыт на ночь.

Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в передней части каждой зоны постоянно оказываются в области чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны. Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем немного сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедительная иллюстрация эффективности такого противодействия была приведена выше (см. рис. 16).

При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести электрофорез в простой непрерывной системе и не очень заботиться об объеме исходного препарата. Сделанное замечание находится в противоречии с цитированными выше недавними работами, где градиентный гель использовали в сочетании со ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при таком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обусловлено определенным консерватизмом и «перестраховкой».

По существу, картина разделения белковых зон при электрофорезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соотношения размеров белков в препарате и характера градиента пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофореза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно использовать любые буферы сравнительно малой концентрации (0,03—0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что для данного метода немаловажно, так как скорости миграции белков при приближении к конечным положениям существенно уменьшаются.

Указанные преимущества объясняют растущую популярность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, ' почему такая ведущая фирма, как «Pharmacia», специализировалась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ. Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами 78х78х2,7 мм для двух интервалов концентраций ПААГ: 2— 16% и 4—30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента пористости в этих пластинах подобран так, что в пределах некоторого диапазона- молекулярных масс нативных глобулярных белков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миграции белка (до конечного положения) от логарифма его молекулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс таковы: для РАА 2/16—от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА 4/30 — от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это означает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с молекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имеющие массу более 2 млн.—не войдут в него. Последняя цифра может относиться, конечно, только к белковым комплексам или нуклеиновым кислотам.

Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, пользоваться и для разделения комплексов белок—ДДС-Na. Ламбен обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный градиент концентрации ПААГ в интервале 3—30% позволяет проводить электрофорез до полной обстановки белков с молекулярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо следующее линейное соотношение: lg M = A lg T+B, где М— молекулярная масса белка, а Т—концентрация ПААГ в месте расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от начала пластины. А и В—коэффициенты, указывающие на линейный характер зависимости. Определять их нет нужды, если имеется возможность воспользоваться, как обычно, набором маркерных белков. Обработку исходного препарата можно проводить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ с ДДС-Na [Lambin, 1978].

Недавно Ламбен и Фаин [Lambin, Fine, 1979] предложили способ определения молекулярной массы нативных белков (без ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте концентрации ПААГ (3—20%). Оказалось, что для любого белка характер его непрерывно замедляющегося движения в таком геле хорошо описывается линейной зависимостью: ??t=aD+b, где t—любой момент времени с начала электрофореза, пока белок еще движется; D—пройденное им к этому моменту расстояние в геле; а и b — постоянные в данном опыте величины.

Для каждого конкретного белка такую зависимость легко получить экспериментально. Удобно, например, в разные карманы одной пластины геля последовательно, через известные про-межутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на пластине будет известна продолжительность электрофореза, а расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точкам строят график зависимости ??t от D, имеющий вид прямой линии. Тангенс угла наклона этой прямой—значение коэффициента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффициент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что соотношение между логарифмами коэффициента а и молекулярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный характер в широком интервале молекулярных масс—от 20 до 950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном уравнении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для трех стандартных буферов: фосфатного (рН 7,2), Трис-боратного (рН 8,2) и Трис-барбитуратного (рН 9,8). Так, для 0,01 М Na-фосфатного буфера (рН 7,2) имеет место зависимость:

Lg M = l,93 lg a + 6,99. Точность определения молекулярной массы невысока—в среднем ±20%. Однако важное достоинство метода состоит в возможности оценивать суммарную молекулярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссоциируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя результаты определения молекулярной массы некоего белка описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строение белка.

В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хорош только для разделения белков по размерам. В случае разделения по заряду он может даже ухудшить результат, так как белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же месте.

Двумерный электрофорез в пааг

Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда удается осуществить в ходе одного опыта даже с применением описанных выше приемов повышения разрешающей способности электрофореза в ПААГ. Всегда достаточно высока вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения значений их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после первого электрофоретического фракционирования смеси белков следует проверить на гомогенность, используя ее как исходный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно сделать одновременно для всех полос первого разделения, или, как его часто называют, «разделения в первом направлении». Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека из пластины первого направления, накладывают на стартовую зону пластины «второго направления». Контакт между двумя гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стартовым буфером или, для надежности, расплавленным раствором агарозы в этом же буфере. Электрофорез ведут в направлении, перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомогенная белковая полоса может дать несколько пятен, если при новых условиях электрофореза подвижности первоначально образовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми. В результате на пластине второго направления после прокрашивания выявляется картина распределенных по всей поверхности пятен, напоминающая «фингерпринт» в двумерной тонкослойной хроматографии. Число пятен, которое удается различить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к двум тысячам (!).

При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно, чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из трубки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщиной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине следует образовать продольно расположенную полость, предпочтительно клиновидного сечения, куда можно заложить цилиндрик геля и залить'его там буфером, агарозой или даже заполимеризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образования и форма сечения этой полости не играют большой роли. Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или полоска геля первого направления должны лежать параллельно краю геля в пластине второго направления. Можно, например, воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис. 23). Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для электрофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978a]. Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают плоский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вырезания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии) удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].

В каждом из направлений двумерного электрофореза используют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую специфическим особенностям фракционируемых белков. Широкое применение двумерный электрофорез нашел, например, для Рис. 23. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman, Dowberi, 1978a] Рис. 24. Результаты двумерного электрофореза рибосомальных белков [Mets, Bogorad, 1974] I—первое направление; II—второе направление анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном, слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют чаще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель, чтобы различие молекулярных размеров по возможности не сказывалось на разделении белков в этом направлении, т. е. не накладывалось на разделение по заряду. Во втором направлении в этом случае белки разделяют по их размерам.

Так, Мете и Богорад электрофорез рибосомальных белков в первом направлении проводили в трубках диаметром 4 мм и длиной 10 см [Mets, Bogorad, 1974]. 4%-ный ПААГ полимеризовали в буфере с рН 5. При этом все рибосомальные белки заряжены положительно и различия значений их суммарных зарядов выражены наиболее ярко. В буфер вводили 8 М мочевину, чтобы помешать агрегации белков. При полимеризации геля вносили больше ТЕМЕД, чем персульфата аммония (0,1 и 0,03%), так как в кислой среде каталитическая активность ТЕМЕД понижена (см. главу 2). 0,1—0,2 мг смеси рибосомальных белков вносили растворенными в 8 М мочевине с 10 мМ дитиотреитолом. Разделение вели при силе тока 1,5 мА на трубку в течение 4—5 ч. Во втором направлении использовали ступенчатый электрофорез. Рабочим гелем служил 10%-ный ПААГ, полимеризованный в буфере с рН 6,75. Формирующий гель— такой же, как гель первого направления (4% ПААГ, рН 5). Его полимеризовали вокруг геля из трубки, уложенного в клиновидное расширение над пластиной. Концентрацию мочевины в этом геле снизили до 7 М, чтобы цилиндрик не мог всплыть во время полимеризации. В качестве медленно мигрирующего иона верхнего электродного буфера использовали MES (2-(N-морфолиноэтенсульфокислоту) — продажный препарат для составления буферов с рКа 6,15. Быстрым ионом служил остаток уксусной кислоты. В состав верхнего буфера ввели также 1% ДДС-Na и 0,01% тиогликолевой кислоты, которая, как уже упоминалось, служит для очистки гелей от остаточных свободных радикалов персульфата аммония. Она мигрирует из электродного буфера в гель, где и движется впереди белков. Отметим, что преэлектрофорез в ступенчатой системе невозможен—он нарушил бы распределение ионов по ступеням. Однако его можно провести предварительно, использовав в качестве верхнего обычный буфер с быстро мигрирующим ионом, а затем заменить его, как описано выше. Верхний электрод является катодом, анод расположен внизу. Под действием поля ДДС-Na из верхнего электродного буфера мигрирует в гель. В цилиндрике геля первого направления он образует комплексы с белками. Далее отрицательно заряженные комплексы белок — ДДС-Na выходят из цилкндрика и фракционируются ступенчатым электрофорезом в пластине. Обработка белков ДДС-Na, таким образом, 'происходит в отсутствие ?-меркаптоэтанола. Его отчасти заменяет мочевина; кроме того, исходно, до электрофореза в первом направлении, белки восстанавливают 10 мМ дитиотреитолом. Электрофорез во втором направлении ведут в течение 5 ч при силе тока 25 мА на пластину. Метод удобен тем, что между разделениями в первом и втором направлениях нет надобности вымачивать гель, так как буфер геля первого направления—тот же, что и у формирующего геля второго направления. Результаты электрофореза представлены на рис. 24.

В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосомальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в 4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трисборатном буфере, рН 8,7. При этом рН часть белков рибосом оказывается заряженной отрицательно, а другая часть—положительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной 1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвердевания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси мономеров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавленном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряжения миграция белков шла в обе стороны—к катоду и аноду. Во втором направлении разделение белков вели по их размерам, но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину еще. более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (T= =18,25; С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кислоте, титрованной КОН до рН 4,5, также с добавлением 6 М мочевины. В этом случае все белки были заряжены положительно и мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя использовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля вдоль его продольной оси вырезали плоскую полоску, вымачивали ее в 0,013 М К-ацетатном буфере (рН 5,2) с 8 М мочевиной. Полоску зажимали между стеклянными пластинками формы и прямо на нее заливали раствор мономеров рабочего геля. Катионом верхнего электродного буфера служил глицин (~0,19 М), титрованный уксусной кислотой до рН 4. Таким образом, осуществлялась система ступенчатого электрофореза, где в качестве быстрого иона выступал К+, а медленного—глицин. Отметим, что в системе Орнстейна и Дэвиса глицин фигурировал в качестве медленного аниона, а здесь он служил катионом. Возможность такого двоякого использования вытекает из цвиттерионной природы глицина. Формирующим гелем в этой системе служила сама полоска, вырезанная из геля первого направления. Аналогичная система двумерного электрофореза рибосомальных белков описана и в другой работе [Sherton, Wool, 1974]. .