MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных белков по заряду в первом направлении использовал ступенчатый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с рН 4,6— в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с рН 6,5—в формирующем). Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуществлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения с маркерами во втором направлении) и оценены их количественные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени крысы.

Интересный подход к фракционированию рибосомальных белков был использован в недавней работе [Hoffman, Dowben, 1978b]. При разделении в первом направлении авторы использовали различие в протяженности гидрофобных участков поверхности у разных белков рибосомы. Оно проявлялось в степени связывания этих белков с мицеллами Тритона Х-100, который вводили при полимеризации геля до концентрации 0,15%. Комплексы белков с Тритоном Х-100 разделяли по размеру в 8%-ном ПААГ в присутствии 2 М мочевины. Концентрация детергента была оптимальной; при меньших концентрациях он мало влияет на подвижность белков, а при больших, как уже отмечалось, препятствует последующей обработке ДДС-Na, который в этой работе использовали при фракционировании белков во втором направлении. Подробнее об использовании Тритона Х-100 в этих целях будет сказано в следующем разделе.

В качестве лидирующего красителя при фракционировании рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предложено использовать FeCl3. Ионы Fe3+ в присутствии уксусной кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, мигрирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных белков [Bernabeu et al., 1979].

Рис. 25. Сочетание хроматографии с электрофорезом в геле агарозы fBloom, Anderson, 1979] 1 — хроматографическая колонка; 2—обессоливавие в «биофибрах», 3 — перистальтический насос; 4— раствор агарозы; 5 — нагреватели; 6— трубка для электрофореза; 7— охлаждающая смесь Рис. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (направление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление II) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979] Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие щелочные белки. Например, факторы инициации белкового синтеза из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционировании каждого из них в первом направлении по заряду в кислой мочевине, а во втором—по размерам ступенчатым электрофорезом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979].

Двумерный электрофорез белков хроматина описан Бакаевым и соавторами (Bakayev et al., 1978]. В первом направлении хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в 5%-ном ПААГ и буфере низкой ионной силы (0,01 М ТЭА-НС1, рН 7,6) на олиго-, моно- и субнуклеосомы за счет заряда входящей в их состав ДНК, как это было описано выше. Во втором направлении авторы использовали в одном случае фракционирование белков хроматина по размеру в системе Лэммли после вымачивания геля первого направления в 1%-ном растворе ДДС-Na. Детергент обеспечивал и диссоциацию белков от ДНК. В другом варианте разделения диссоциацию осуществляли с помощью цетавлона, а электрофорез во втором направлении вели в кислой мочевине. Во втором варианте хорошо выявлялась группа быстро мигрирующих негистоно•вых белков хроматина (HMG-белков). Для анализа этих белков авторы экстрагировали их 0,35 М раствором Nad, очищали осаждением ТХУ (2—20%) и разделяли двумерным электрофорезом, причем в первом направлении использовали фракционирование по заряду в кислой мочевине, а во втором — разделение по размерам в 15%-ном ПААГ после обработки ДДС-Na.

Двумерный электрофорез субъединиц различных РНК-полимераз в уже цитированной работе д'Алессио и соавторов проводили в двух вариантах разделения белков по заряду в первом направлении. В обоих вариантах использовали ступенчатую систему электрофореза: в одном—с кислым буфером (рН 4,3) для рабочего геля, в другом—со щелочным (рН 9,4). Во втором направлении в обоих случаях белки фракционировали по их размерам после обработки ДДС-Na в системе Лэммли [d'Alessio et al., 1979].

Мы не случайно в качестве примеров двумерного электрофореза рассмотрели только случаи фракционирования щелочных белков. Для кислых белков все другие варианты двумерного фракционирования вытеснила уже упоминавшаяся система О'Фарелла. Щелочные белки до последнего времени плохо разделялись в этой системе, однако недавно была предложена ее модификация, позволяющая успешно вести разделение и щелочных белков.

Блум и Андерсон предложили оригинальный метод двумерного разделения белков [Bloom, Anderson, 1979]. Собственно, электрофорез в нем используется только во втором направлении. Фракционирование белков в первом «направлении» осуществляется на хроматографической колонке (рис. 25). Элюат с колонки обессоливают, пропуская его через «биофибры», погруженные в 10%-ный раствор ДДС-Na с 1% ?-меркаптоэтанола. Затем его подогревают до 96° и по каплям смешивают с раствором расплавленной при такой же температуре агарозы. Оба раствора подают одним двухканальным перистальтическим насосом, и горячая смесь постепенно заполняет погруженную в лед трубку. Таким образом, в трубке полимеризуется элюат с хроматографической колонки, т. е. по длине геля располагаются белковые зоны в той последовательности, как они выходят из колонки. Затем гель извлекают из трубки и накладывают на пластину ПААГ, заливают расплавленной агарозой и ведут электрофорез в системе Лэммли. В частности, авторы элюировали гистоны с колонки оксиапатита линейным градиентом концентрации NaCl (0—1,5 М) в 1 мМ Na-фосфатном буфере (рН 6) с 6 М мочевиной. Гистоны выходили, не разделившись, а лишь растянувшись по элюату. Во втором направлении использовали электрофорез в присутствии ДДС-Na в градиенте пористости ПААГ (8—25%). На пластине гистоны оказались прекрасно отделенными друг от друга (рис. 26). В частности, гистоны Н2А и Н2В далеко отошли от НЗ благодаря значительному различию в их сродстве к оксиапатиту.

Исходный препарат в такой постановке опыта может быть и не элюатом с колонки, а реакционной смесью, в которой со временем происходят изменения белкового состава, например в результате протеолиза. Маркерные белки с известной молекулярной массой можно прикалывать при заполнении трубки так, что их положение по ее длине будет заведомо определенным.

Электрофорез с использованием тритона х-100 И цетавлона

Тритон х-100

Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, плохо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 зачастую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их биологическая активность.

Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли белки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в 1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с белком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость белка, однако разделение полос оказывается более надежным, если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксировании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, который приходится дольше отмывать.

Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использовать не только для растворения, но и для фракционирования белков. Характер комплекса и количество связавшегося с белком детергента зависят от протяженности гидрофобного участка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на молекулу (родопсин—до 70). Это дает прирост эффективной молекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон (молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.

В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] белки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентрации 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5% (?-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в определенной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого процесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и мочевины для данного типа белков подбирают экспериментально. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксусной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100. Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено пониженное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иногда, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содержащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним приходится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внимание следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в электродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кислоту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мочевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поменяв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при постоянном напряжении 100 В в течение суток при той же полярности напряжения (белки мигрируют к катоду).

В рассматриваемой работе удалось наблюдать значительные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. соli и даже мутантов одного штамма. Было использовано и двумерное разделение. Полоски геля после электрофореза в присутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сначала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После этого их переносили на вторую пластину для ступенчатого электрофореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочевины или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.

Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочевиной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {?-цепей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатурацию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (?-меркаптоэтанола, так как окисление может существенно изменять гидрофобные свойства белка.

Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле, полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также преэлектрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином. В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гистонов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфера геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М мочевины.

Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100 использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомальных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, поэтому при электрофорезе в первом направлении благодаря комплексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосомальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны мигрируют вместе с относительно более крупными белками рибосом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить различие истинных молекулярных масс этих двух типов белков. ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и относительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,. отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].

Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направлений, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Garnird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977]. В последние годы описано применение в тех же целях других, сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы «Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А печени и других органов мыши при этом удалось разделить на два компонента, гистон НЗ—на три или четыре; в ряде случаев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979] был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризованном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+ +Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направлении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.

Цетавлон

Цетилтриметиламмонийбромид (цетавлон) — положительно заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na растворяет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеиновые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофорезе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавторы предложили заменить ДДС-Na на цетавлон [Panyim et al., 1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению белков за счет связывания с гидрофобными участками полипептидов. Благодаря электростатическому отталкиванию положительно заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи распрямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетавлоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положительно. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми кислотами как «жирный катион» и осаждает их из, раствора.

Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаимодействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при слегка повышенной температуре (37°), в термостате. Кроме того, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окрашивание геля ведут при температуре 80—100°.

Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использовали 10%-ный ПААГ (С=1,5), полимеризованный в 0,09 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) с 0,09% цетавлона. Примерно таким же буфером заполняли электродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до концентрации 0,25—0,5 мг/мл в 0,0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) с 0,5% цетавлона и 1% р-меркаптоэтанола. Назначение последнего — такое же, как при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инкубировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На трубку (10x0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5—10 мкг белка). Электрофорез вели при силе тока 8—10 мА на гель и напряженности поля 8—10 В/см. В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный раствор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30—60 мин при температуре 80—100°. Отмывали излишек красителя в 0,9 М уксусной кислоте при той же температуре.

Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки цетавлоном также наблюдается линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его миграции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать молекулярные массы белков в интервале 15—90 тыс. дальтон.

Эли и соавторы недавно предложили модификацию описанной выше системы [Ely et al., 1979J. Они заменили персульфат аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициатора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН растворим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаждения цетавлона при полимеризации геля.

В качестве рабочего буфера геля использовали U,l М Na-фосфат (рН'7) с 0,l% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфере, но содержащем 0,5% цетавлона и 10—15% р-меркаптоэтанола. Лидирующий красительмалахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на трубку (10x0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 4'5% этанола, в течение 10ч.

Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциации белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с цетавлоном. При низких значениях рН связывание цетавлона с гистонами и негистоновыми белками хроматина носит избирательный характер, что способствует их электрофоретическому разделению.

Фракционирование белков по степени их гидрофобности можно преобразовать в разделение по заряду с помощью следующего приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли размеров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворенной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCI и 0,5% Тритона Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом «со сдвигом заряда» [Bhakdi et al., 1977] А — без дополнительных детергентов; Б — с добавлением ДОХ; В—с добавлением цетавлона Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дезоксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками белка в количестве, пропорциональному размеру этих участков. Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешанные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответственно положительный или отрицательный заряд, существенно превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и величиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать «электрофорезом со сдвигом заряда». Необычное введение в буфер геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости белков, так и образованию, мицелл. Напряженность поля при этом приходится снижать до 4,5 В/см.

Аналогичный подход был использован для обнаружения гидрофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, переносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы, но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во втором направлении (II) все гидрофильные белки ложились на диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали из нее (рис. 27).

Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавлоном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам выявить значительное число дополнительных фракций при разделении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направлениях использовалась система ступенчатого электрофореза (3,3%-ный ПААГ—формирующий, 15 %-ный— рабочий). Полимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в первом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При этом отпадала необходимость вести электрофорез во втором направлении немедленно по окончании первого разделения И обеспечивалась возможность оценить качество последнего. Цетавлон, который вносили в верхний электродный буфер (0,15%), мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для предупреждения фотоокисления гистонов гели держали вдали от яркого света [Bonner et al., 1980].

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru