Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование

(практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.

В книге детально описана современная аппаратура, изложены практические приемы постановки экспериментов, проанализировано влияние на их результаты различных физико-химических параметров. Рассмотрены все варианты и модификации описываемых методов. Даны ссылки на оригинальные экспериментальные работы, опубликованные в ведущих журналах мира по декабрь 1980 г.

Книга рассчитана на биохимиков, медиков, фармакологов, работников пищевой промышленности. Табл. 4, илл. 77, библиогр. 294 назв.

Ответственный редактор член-корреспондент АН СССР Г. П. ГЕОРГИЕВ

Часть первая электрофорез

Введение

Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала (рис. 1, справа).

На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны некоторые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два электрода, представленные спиральками из платиновой проволоки, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся в них буферные растворы и рабочий канал замыкается электрическая цепь между электродами.

Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность можно обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную форму. Такие приборы использовались на первых этапах развития метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое: в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных приборах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80—99,5%), в которой (т. е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серь езно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномерности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость миграции макромолекул в электрическом поле зависит от температуры. Неравномерность нагревания геля неизбежно приведет к искажению зон и ухудшению их разделения.

В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые макромолекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фотографии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллельных «треков», исчерченных поперечными полосами окрашенных зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклеотиды различной длины.

Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Преимущества пластин не ограничиваются экономией времени и места при обработке большого количества препаратов. Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза Горизонтальные полоски — окрашенные белковые зоны Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК Окраска люминесцентным красителем (бромистым этидием) ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содержание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряженность электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования разных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их состава путем сравнения положения полос в параллельных треках. Если добавить к этому значительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пластинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной исключительная популярность этой системы электрофореза в последние годы.

Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются современные методы электрофореза. В качестве «носителей» жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан.

Рассмотрение начинается с характеристики исходных материалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освободить дальнейшее изложение от повторений, будет описана техника приготовления гелей и соответствующая аппаратура. Гла ва 3 посвящена электрофорезу белков. После замечаний общего характера будут подробно рассмотрены различные современные приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы вынесены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации радиоактивности фракционированных белков, поскольку эти приемы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов электрофореза. Главу заключает описание способов препаративного разделения белков. Такая же структура изложения принята для рассмотрения электрофореза нуклеиновых кислот (глава 4). Замечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во многом относятся к фракционированию обоих типов биополимеров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих последних главах для иллюстрации различных экспериментальных приемов электрофоретического разделения биополимеров разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом приводятся только наиболее существенные данные. Более детальное описание следует искать в оригинальных публикациях, на которые будут даны ссылки.

Глава 1. Гели для электрофореза

Полиакриламидныи гель (пааг)

Исходные материалы

Акриламид (СН2?=?СН?—?CONH2) представляет собой белый кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (А290) не должна превышать 0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и растворять его следует в перчатках и под тягой.

Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать. Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до —?20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-поглощающих примесей акриламид можно обработать активированным углем. Для этого в маточный 30?—?40%-ный водный раствор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемешивают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а затем через стекловолокнистый фильтр.

NN'-Метиленбисакриламид («Бис») – (CH2?=?CH?—?CONH)2?– СН2 — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров акриламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.

В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат — СН2?=?СН?—?СО?—?O?—?СН2?—?СН2?—?О?—?СО?—?СН?=?СН2, а также NN'-диаллилтартардиамид (ДАТД) — CH2?=?CH?—?CH2?—?NH?— CO?—?CH(OH)?—?CH(OH)?—?CO?—?NH?—?CH2?—?CH?=?CH2. С их помощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за 20?—?30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кислоте. Использование растворимых гелей на основе акриламида будет рассмотрено ниже.

Персульфат аммония производится в виде белого кристаллического порошка или гранул. Его используют в качестве инициатора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония приводит к образованию двух достаточно долго живущих свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода:

Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома углерода:

Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы акриламида с образова нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид. Второй его конец может точно так же оказаться в составе другой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».

Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлагается, поэтому следует использовать только свежеприготовленные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он медленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препараты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены, но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата аммония в воде имеет рН?2, то он непригоден. Отметим попутно, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с успехом использовать, например, персульфат калия.

Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желтооранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворяется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желтозеленую окраску.

Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации. При освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина. Последний снова легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО?), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.

К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком строгие требования, так как он, являясь очень эффективным инициатором, используется в гораздо меньших концентрациях (~?0,005%), чем персульфат аммония.

Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) — (СН3)2N?—?CH2?—?CH2?— —?N(СН3)2 — представляет собой бесцветную жидкость с плотностью 0,78 г/см3. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД — около 6,7 М.

ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором полимеризации акриламида, но служит катализатором этого процесса, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации акриламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значительно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к персульфату.

В качестве катализатора в последнее время нередко используют диметиламинопропионитрил — (CH3)2N?—?СН2?—?CH2?—?CN (M?=?102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вносят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.

Процесс полимеризации пааг

При подготовке определенной серии опытов удобно заранее приготовить концентрированный (30?—?40%) водный раствор акриламида и метиленбисакриламида с определенным соотношением обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточный раствор буфера, например 10-кратной концентрации. ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в воде непосредственно перед началом опыта.

Для приготовления геля маточные растворы мономеров и буфера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную конечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до расчетного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и заливают в трубку или между стеклами для формирования пластин. При правильном выборе концентраций персульфата и ТЕМЕД полимеризация занимает 30?—?40 мин. Ее следует вести вдали от яркого источника света.

Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс. Наибольшую опасность для нормального протекания полимеризации акриламида представляет растворенный в воде кислород, молекула которого является определенного рода бирадикалом и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикальной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов необходима именно для удаления из нее растворенного кислорода. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием — так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но как только интенсивное выделение пузырей газа закончится, деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испарения воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при комнатной температуре.

Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора осторожно наслаивают до высоты 3?—?5 мм деаэрированную кипячением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке формы через иглу от шприца с помощью перистальтического насоса. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем вновь появляется, что указывает на окончание процесса полимеризации.

Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то форму с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой «дневного света» с расстояния около 5 см в течение 30?—?45 мин. Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распада не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как ион персульфата может вступать в реакцию с белками, созда вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда это существенно, персульфат удаляют путем предварительного электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не менее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отдают персульфату, поскольку при работе с рибофлавином довольно трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования растворов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом количестве, для самого процесса инициации с участием рибофлавина.

Полимеризация — экзотермический процесс, поэтому в случае высокой концентрации акриламида во избежание образования пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образования свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее продолжительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимеризацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести на холоду.

Гель получается наиболее однородным, если время полимеризации составляет 30?—?40 мин. Обычно этого добиваются эмпирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата. Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимости от концентрации акриламида и качества самого персульфата. С увеличением содержания акриламида концентрацию персульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно внести различные количества данного препарата персульфата в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида, наблюдая продолжительность полимеризации в них.