MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно обнаружить, составляет примерно 10-4 мкг/мм2. По приведенным в работе фотографиям создается впечатление, что чувствительность метода столь же высока, как и первоначальной методики Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом случае также возможно ослабление с помощью фотоослабителей.

Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется предварительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в течение 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, промыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси метанол — вода — глицерин (70 : 27 : 3) в течение 5 мин.

В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их первого метода, где был использован гистологический подход, в данном случае восстановление серебра происходит фотохимическим путем.

После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксируют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12% СН3СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин—5%-ной СН3СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают раствором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл 37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего средства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-. вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2CO3, содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-. ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашивания прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН3СООН, а затем промывают его водой.

Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее описанных методов окраски серебром, но процедура существенно проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].

Флюоресцентные красители

Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые—при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их поглощения в растворе лежит в области 330—360 нм, флюоресценции — 510 нм. Молярная экстинкция E=4,3 · 106.

В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность флюоресцировать сохраняется.

Данзилирование белков и пептидов позволяет следить эа ходом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции белков при данзилировании практически не изменяется, поэтому небольшие примеси данзилированных препаратов можно использовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных белковых смесей.

Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет проводить пептидный анализ данзилированных белков после их разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые, но и внутренние пептиды. Дело в том, что Данзилирование, хотя и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам, происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цистеина и тирозина, ?-NН3-группам лизина и по гистидину. Ценным является то обстоятельство, что автолиз неданзилированных протеаз не создает никаких помех при картировании пептидов.

Недавно описано Данзилирование белков для последующего разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na (в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (рН 8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют 1/15 объема 10%-ного. раствора данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, инкубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутножелтую суспензию, тем не менее Данзилирование в ней происходит. Раствор просветляется после добавления 1/15 объема ???мер? каптоэтанола и дополнительной инкубации в течение 15 мин. Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхлорида.

Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки подвергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные продукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения белков под контролем данзилированных аликвот. При этом используется электрофоретическая элюция белковых полос из геля. Описан также пептидный анализ разделенных белков электрофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабочего геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом [Stephens, 1975].

Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наименованием «Fluram») — желтовато-белый порошок, хорошо растворимый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хранить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, особенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными аминами (концевыми аминогруппами, ?-NH2-группами лизина) в водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие продукты в соответствии с представленной ниже схемой.

Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и максимум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюоресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресцируют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт можно не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При использовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит дополнительный отрицательный заряд (за счет образующегося карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.

В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали для окраски белков после их двумерного фракционирования влектрофокусировкой и электрофорезом по методу 0'Фаррела. Белки фиксировали в пластине геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюоресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на 1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2ч — в 0,04 М раствор борной кислоты в ДМСО, титрованный NaOH до рН 10. Затем добавляли равный объем раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение 8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при освещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.

Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствительность и разрешающая способность окраски флюоресцамином примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок зависимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количества белка больше — вплоть до 7 мкг белка на 1 см2 в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не далее, чем для 3 мг/см2.

Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974]. Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации 0,5—1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) с 5% ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза. Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично использовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофорезом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано использование для окрашивания белков перед электрофорезом родственного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-дифенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин, этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.

В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирующего продукта — при 390 нм, флюоресценции — при 745 нм. Реакция идет лучше в щелочной среде (рН 9,5.) Продукт устойчив в интервале рН 2—10. Интенсивность флюоресценции—в 2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь незначительно уменьшается в случае предварительной обработки белка ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствительность метода очень высока: по утверждению авторов, им удавалось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких месяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окрашивание ведут в 0,01 М боратном буфере (рН 9,5), энергично перемешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.

Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделением электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды, обработанные ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом, окрашивали в 0,1 М Li-боратном буфере (рН 9,5), добавляя к ним в пятикратном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.

Ортофталевый альдегид (ОФА) в присутствии ?-меркаптоэтанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов, давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с приведенной ниже схемой.

ОФА растворим в воде, но лучше—в метаноле, этаноле, ацетоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при рН 8—9. При использовании ОФА его сначала растворяют в одном из перечисленных органических растворителей, а потом смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и значения рН. Максимум возбуждения флюоресцирующего продукта — при 340 нм, флюоресценции — при 445 нм. Раствор самого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода — выше, чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных продуктов выражен сильнее.

Использование ОФА для окрашивания комплексов белок— ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Weidekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% ?-меркаптоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда добавляли 1/5 объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и выдерживали в темноте 2—3 ч.

Локализация ферментов после электрофореза

В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях (без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности. Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с помощью специфических реакций, дающих окрашенные продукты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофакторов, необходимых для протекания определенной ферментативной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует, его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продвижением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять, каково будет поведение субстрата в электрическом поле во время электрофореза.

Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом («индикаторном») геле на основе агарозы или импрегнировать ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность накладывают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикаторных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в качестве заключительного этапа реакции воспользоваться неферментативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,. что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продукты (схема реакции приведена ниже), В качестве примера можно назвать часто употребляющийся препарат «Methyl thiazolyl blue» (MTT) или еще более сложное соединение «Nitro blue tetrazolium» (NBT). В окисленном виде обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает синепурпурную, а вторая—иссиня-черную окраску. Реакция восстановления красителей ускоряется в присутствии промежуточного переносчика электронов «Phenazine methosulfate» (PMS) или нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели фирмой «Boehringer» под названием «Meldolablue» [Turner, Hopkinson, 1979].

Для обнаружения в геле протеолитических ферментов предложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофореза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и 1,7 мМ CaCl2. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диффундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с, остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне [Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотопленке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушающих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымывают.

Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Можно также исследовать оптимизацию условий, необходимых для активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробовать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз. Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяснения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окрашивание бромистым этидием в описанных опытах можно заменить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризовать меченную 32Р нуклеиновую кислоту или синтетический полинуклеотид [Iborra et al., 1979].

Выше указывалось, что для локализации ферментов по их активности электрофорез желательно проводить в условиях, исключающих возможность денатурации. Однако в недавней работе [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку целого ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки их детергентом при повышенной температуре. Денатурация оказывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na отмывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, рН 7,6. Ферментативная активность в ряде случаев восстанавливается.

По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермента имеет смысл денатурировать его кратковременной обработкой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при разбавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предварительную обработку (?-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исключить. Впрочем, то же самое относится и к одноцепочечному трипсину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S—S-связей в нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.

В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофореза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой, например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979], или радиоактивно меченного введением 125I [Horst et al., 1980].

Локализация белковых полос осаждением ддс-na

Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы позволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в присутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0—4°. При боковом освещении на фоне черного бархата непрозрачные белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачного геля. По-видимому, комплексы белок—ДДС-Na служат ядрами конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, растворимость которого очень сильно зависит от температуры. При отргревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чувствительности этого метода — 0,2 мкг белка на 1 мм2 площади пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описанный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5—10 мин при —70°. В местах расположения белковых зон за счет связывания части свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая непрозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрачным [Bachrach, 1981].

Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25° в 10—12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, выпадает в осадок — гель становится белым и непрозрачным. Белки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрачные полосы хорошо видны на темном фоне при освещении геля сбоку и снизу. Чувствительность метода — 0,1 мкг белка на 1 мм2 площади пятна или полосы.

Элюция белков из геля

Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из полоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного времени при 37—40°. Этот прием пригоден как для свободных белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения диффузии белков из геля последний измельчают, например растирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элюции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда электрофорез белка проводили без него. Это делают для облегчения растворения белков. После окончания экстракции гель удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью ацетона с 0,1 М НС1 (6: 1), а затем чистым ацетоном. Осажденный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом белок в 0,05 М Na-фосфатный буфер <рН 7,5) с 0,1% ДДС-Na и 1 мМ ФМСФ ' при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавлением КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомогенизировали кусочки геля в малом объеме 1%-ного раствора ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая концентрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окра.шивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna et al., 1980] белки, предназначенные для последующего аминокислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в 0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инкубацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после растворения лиофилизированного препарата в воде до концентрации 1 % по ДДС-Na.>

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru