MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Иногда для улучшения растворения осажденного в геле белка экстракцию ведут в 1%-ном ДДС-Na с 6 М мочевиной [Buisson et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина можно экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rabbani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза и окраски СВВ R-250 можно также элюировать 66%-ной уксусной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей природе краситель десорбируется с белка и полностью задерживается на анионообменнике, а щелочные рибосомальные белки с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980].

Описан способ экстракции белков в комплексе с ДДС-Na 60%-ной муравьиной кислотой [Gibson, Cracy, 1979], которую —————— 1 Фенилметилсульфонилфторид — ингибитор протеаз.

затем упаривают, а сухой остаток суспендируют в 6 н. НС1. Белок при этом растворяется, а ДДС-Na остается в осадке. Его удаляют центрифугированием, а краситель из раствора белка в кислоте извлекают троекратной экстракцией октанолом. Соляную кислоту удаляют высушиванием в струе азота, разбавив предварительно препарат водой.

Возможен и другой подход. Сначала ДДС-Na и краситель экстрагируют из ПААГ без растворения осажденного в полосах белка. Этого добиваются пятикратной гомогенизацией геля в растворе, содержащем 10% ТХУ и 30% этанола. Гель каждый раз осаждают центрифугированием. Из очищенного таким образом геля белки экстрагируют 0,1 М NaOH в течение 2 ч при 37° при встряхивании [Djondjurov, Holtzer, 1979]. Для малых концентраций белков в полосах этот метод не подходит, так как часть белков вымывается при обработке геля ТХУ.

Нефиксированные белки удобно извлекать из геля возобновлением электрофореза до выхода белка из геля. Содержащую нужный белок полосу (или пятно) в геле локализуют сопоставлением с окрашенными белками в параллельном контрольном треке на пластине, который предварительно отрезают, или в контрольной трубке. Можно фиксировать положение полос и с помощью данзилированных маркеров (см. выше). Вырезанный из геля участок помещают в трубку на небольшую «пробку» из крупнопористого ПААГ или агарозы и заливают буфером, а на нижний конец трубки надевают заполненный буфером диализный мешочек. Затем возобновляют электрофорез и ведут его до тех пор, пока белок не выйдет из трубки в мешочек [Weliky et al., 1975]. Особенно удобно следить за выходом белка при наличии данзилированных маркеров. Если находящийся в диализном мешочке буфер содержит в избытке неионный детергент (2% NP-40) и 8 М мочевину, то ДДС-Na практически полностью вытесняется из связи с белком и уходит через мембрану к аноду [Tuszynski et al., 1977].

Описан вариант, при котором белок электрофоретически элюируют в трубку большего диаметра, где на пробке из ПААГ лежит слой оксиапатита, уравновешенного 0,1 М Na-фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,1% ДДС-Na. Несмотря на действие электрического поля, белок собируется на оксиапатите, откуда его затем, разобрав всю систему, можно элюировать 0,5 М фосфатным буфером [Ziola, Seraba, 1976].

Нитроцеллюлозные мембранные фильтры обладают способностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользоваться для получения «реплики». Фильтр накладывают на поверхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре можно проводить идентификацию белков, например гибридизацией их с меченной 32Р ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устройство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы, показано схематически на рис. 29. К пластине геля с двух сторон металлическими сетками через пропитанные буфером поролоновые прокладки прижимают нитроцеллюлозные фильтры (18x x18 см) рабочей поверхностью к гелю. Фильтры предварительно смачивают буфером, чтобы в них не оставалось окклюдированного воздуха. Для этого следует дать им некоторое время поплавать на поверхности буфера, а потом уже погрузить в него. Если электрофорез шел в присутствии ДДС-Na, белки пред Рис. 29. Устройство для диффузии белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр [Bowen et al., 1980] / — сетка из нержавеющей стади; 2 — поролон; 3 — нитроцеллюлозиый фильтр; 4—ПААГ варительно освобождают от него, вымачивая гель в 0,01 М растворе Трис-НСl (рН 7), содержащем 0,05 М NaCl, 2 мМ ЭДТА и 4 М мочевину, в течение 3 ч с перемешиванием. Для более полного освобождения от ДДС-Na в этот раствор можно сначала ввести 1% Тритона Х-100, а потом отмывать тем же буфером без детергента. Собранную, как описано выше, многослойную систему погружают в 2 л того же буфера, но без мочевины. Диффузия идет при комнатной температуре в течение 36—48 ч с одной сменой буфера.

Белки на фильтре можно окрасить, а .радиоактивные—обнаружить флюорографией (см. ниже). Для этого высушенный фильтр ненадолго замачивают в 10%-ном растворе ППО в эфире и накладывают на него рентгеновскую пленку. Флюорография или авторадиография с фильтра идет значительно лучше, чем с геля, так как белки сорбируются на поверхности мембранного фильтра.

Выход белков из геля на фильтр можно значительно ускорить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пластины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это было описано для электрофоретической отмывки красителя [Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллюлозный фильтр («Millipore НА») накладывают на гель только с одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под действием электрического поля. Весь «сэндвич» помещают в прибор для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см. Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (например, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в 0,7%-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцеллюлозе. Однако не следует допускать перегрузки фильтра: его сорбционная емкость составляет примерно 0,15 мкг белка на 1 мм2 поверхности. Для проверки можно вслед за первым положить второй листок нитроцеллюлозы — на нем не должно быть белка.

Если разделение белков вели в комплексе с ДДС-Na, то и элюировать их можно в этом комплексе. В таком случае следует использовать буфер того же типа, какой используют для верхнего электродного резервуара ступенчатой системы электрофореза по Лэммли (0,192 М глицин, 25 мМ Трис, 20%-ный метанол; рН 8,3). Направление миграции белков—к аноду. Выход белка при этом получается неполным.

Перешедшие на фильтр белки Таубин и соавторы идентифицировали иммунологически. Подробное рассмотрение метода выходит за рамки этой книги, поэтому ниже он описан лишь вкратце. Фильтр вымачивали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина для насыщения оставшихся свободными центров сорбции, затем инкубировали с антисывороткой к интересующему белку, промывали и инкубировали с «индикаторными» антителами к иммуноглобулинам первой сыворотки, конъюгирован-, ными с флюоресцентным красителем или меченными радиоактивно. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр существенно облегчает их иммунологическую идентификацию, так как крупные молекулы ?-глобулинов плохо диффундируют в гель, тогда как фильтр сорбирует белки на своей поверхности и они легко доступны для антител.

Описанный прием идентификации можно использовать во всех случаях, когда белок способен образовывать специфические комплексы (гормон—рецептор, рецептор—цАМФ, белок—нуклеиновая кислота и др.), — конечно, при условии, что его активные группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу. Впрочем, последнее требование может относиться лишь к небольшой доле молекул белка данного типа, достаточной для идентификации всей полосы.

Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распространение этого метода на любые белки связано с использованием так называемой «диазобумаги», на которой предварительно закреплены афинные сорбенты, например: антитела или антигены [Eriich et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла себе применение главным образом для гибридизации нуклеиновых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для описания ее особенностей. Отметим только способ переноса белков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в системе Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М Na-фосфатным буфером (рН 7,4) с 0,15 М NaCl и 0,5% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером, накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклянную пластинку грузом. Буфер, поднимающийся из кюветы через гель к сухой фильтровальной бумаге, за 1—2 ч при комнатной температуре вымывает основную массу белка из геля. Нужный белок задерживается на афинном сорбенте, остальные же уходят дальше, в фильтровальную бумагу.

Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг

Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радиоактивности белков, а также способы оценки эффективности этих методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы оценки радиоактивности белков после их электрофореза в ПААГ.

Счет радиоактивности в элюатах белка

Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с помощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной, поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля при таком подходе носит более или менее приближенный характер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением белкового раствора.

Один из специфических вариантов счета радиоактивности элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового препарата. В нем используется способность комплекса белок— ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным раствором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату белка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентрации 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ. Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. После этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Использование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комплексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].

Для качественного определения радиоактивности 14С и 125I белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм) можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивности ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C включает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные 10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры .сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всегда при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молекулярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].

Растворение пааг

Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при повышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода. Если белки мечены 14С, то к раствору Н2О2 следует добавить NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный 14СО2. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в такой смеси при 65° в течение 4—6 ч и далее просчитывать радиоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а возможность артефактов — тушения и хемолюминесценции — выше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного растворения геля в Н2О2 с NH4OH иногда предпочитают использовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радиоактивность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Matzura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в 30%-ной Н2О2 с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтиллятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под названием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелочного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ледяной уксусной кислоты.

Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солюбилизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60— 65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при аналогичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New England Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать 3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляционной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель набухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец, недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий 6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10X hydroxide» в 1 л толуола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной температуре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].

Тщательное сопоставление всех перечисленных выше методов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилучшие результаты, по данным автора, дает обработка' предварительно растертого геля в течение ночи при комнатной температуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в толуоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллятора MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Soluene 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития составляет около 60%, а выход достигает 90—95%.

Полное растворение геля легко осуществить в том случае, когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В главе 1 уже был назван в этом качестве NN/-диaллилтapтapдиaмид (ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте растворимого геля используют NN/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpиламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4 при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976] утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более воспроизводимыми характеристиками, чем при использовании ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилилцистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида [Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в ?-меркаптоэтаноле за 2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тонкостей, которые необходимо учитывать во избежание образования дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэтанола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN/-Бисакрилилцистамин в настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и ДОЭБА.

Несмотря на свою кажущуюся привлекательность растворимые ПААГ не получили широкого распространения — скорее всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы, но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отложить до следующей главы.

Импрегнирование сцинтиллятора в гель

Возможен и обратный подход к решению проблемы счета радиоактивности белка после электрофореза — вместо элюции белка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и сохранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна. В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсолютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его—на толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому, лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.

При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачности как это происходит при вымачивании его в этаноле.

Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его разрезание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко распространенная практика разрезания цилиндрика геля на одинаковые диски толщиной 1—1,5 мм неудачна, так как разрез «вслепую» может попасть на середину полосы. В результате этого радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более широкого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.

Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой концентрации белка в полосе, что нередко имеет место при фракционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработка новых высокочувствительных методов окрашивания белков, например серебром, поможет решить эту проблему.

Авторадиография

Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля можно осуществить методом авторадиографии. На гель накладывают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длительного времени в темноте, обычно при комнатной температуре. Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уровня радиоактивности белков экспозиция может длиться от нескольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обычными проявителями, предназначенными для получения максимально контрастного изображения. Под действием ?-излучения участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами, чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испускаемые им ?-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду их сильного поглощения в геле.

Потеря энергии ?-частиц в геле достаточно велика и в случае использования радиоактивного углерода, поэтому перед авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушенного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем метиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на фильтровальную бумагу («Whatman 3MM»), под нее подкладывают пористую прокладку и перфорированную металлическую пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и присоединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пластину геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу пористую основу и накрывают листом тонкой резины, которую присасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высушивание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев невозможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.

Для авторадиографии следует использовать неэкранированную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film», например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадиографии препаратов, меченных тритием, под названием «LKBUltrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности, а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией. Это облегчает проникновение в нее «слабых» ?-электронов трития, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувствительность метода авторадиографии для регистрации 14С можно оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактивность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распределенная по площади 1 см2, надежно регистрируется за 24 ч экспозиции.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru