MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Электрофорез «в кислой мочевине» успешно используют и для фракционирования других щелочных белков: рибосомных, факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе, когда фракционирование «в кислой мочевине» используют в одном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.

Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на белок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор титруют КОН до рН 4,3?—?4,5. При этом надо иметь в виду, что электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует соответствующего уменьшения напряжения, подаваемого на гель.

Описано электрофоретическое разделение гистонов и при рН 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое используется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кроме H1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряжены, поэтому фракционирование идет главным образом по молекулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрегацию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположение полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и Н3, но не влияет на конфигурацию H1 и Н4. По-видимому, эти по следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalkley, 1976].

Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кислых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-боратном буфере, рН 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ [Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимеризуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изоэлектрической точки часть рибосомальных белков оказывается заряженной отрицательно, а другая — положительно. Миграция в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Щелочные белки рибосом при рН 8,7 растворяются с трудом и только в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в буфер геля.

Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракционирование хроматина после его обработки микрококковой нуклеазой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М триэтиламмоний-НСl (рН 7,6; 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой растворимостью хроматина в более концентрированных буферах. Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, мононуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих вне их «ядра» («core»), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду малой электропроводности разбавленного буфера при напряженности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм составляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см занимает 1,5 ч.

Разделение белков по размеру с использованием ддс-na

Существо метода

Рассмотренный выше электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не для характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации, и, наконец, от жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой количественной корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием ДДС-Na позволяет фракционировать белки в зависимости от значений только одного параметра — их молекулярной массы. Для этого белки в исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трехкратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодействий детергент примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на 1 мг белка [Reynolds, Tanford, 1970]. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимых с детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к массе для любого белка, даже для гистонов с их заметным собственным положительным зарядом. Бла годаря электрическому отталкиванию тесно расположенных по поверхности белка остатков серной кислоты полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения. Его малая ось имеет длину 1,6 нм, а размер большой линейно связан с числом аминокислотных остатков, а следовательно, с молекулярной массой белка. Это справедливо лишь для неразветвленных полипептидов, лишенных дисульфидных мостиков, поэтому одновременно с обработкой ДДСNa необходимо обеспечить полную денатурацию белка и разрыв всех S—Sсвязей. С этой целью белковый препарат обрабатывают высокой концентрацией ?-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофоретическая подвижность (и') жесткого комплекса белок?—?ДДС-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением: и'=А?—?В?lg?М, где А и В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и' удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и бромфенолового синего за время электрофореза, т. е. в значениях введенной ранее величины Rf. Такая замена отразится только на значениях коэффициентов А и В. Нет смысла определять эти коэффициенты в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуемой смеси можно провести электрофорез набора белков-«маркеров», молекулярные массы которых точно известны. Разумеется, вся предварительная обработка ДДС-Na и меркаптоэтанолом должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров можно отвести отдельный трек. При использовании трубок маркеры лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гарантировать строгой идентичности условий электрофореза в двух разных трубках.

По окончании электрофореза, измерив пути миграции бромфенолового синего и каждого из маркеров, можно рассчитать значения Rf и, зная молекулярные массы маркеров, построить экспериментальную зависимость lg?M от Rf для данного опыта. Если пористость геля выбрана удачно (см. ниже), такая зависимость получается линейной (рис. 18). Определив теперь rf для интересующего нас белка, из графика можно найти для него величину lg?M и подсчитать M. Положение и наклон прямой на графике изменяются при вариации концентрации ПААГ и других условий эксперимента, поэтому нельзя пользоваться какой-либо стандартной калибровкой. График зависимости Ig?M от Rf надо строить для каждого опыта. Отметим также, что при определении Rf надо вводить поправки на набухание или съеживание геля при фиксации, окраске белков и удалении красителя, приводя все к исходному линейному размеру.

Метод определения молекулярной массы белков электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и используется очень широко. Тем не менее следует проявлять известную осторожность. Исследуемый белок может оказаться принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочисленной, категории белков, для которой количественное соотношение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 : 1,4.

Есть данные о том, что на полноту комплексообразования с ДДС-Na может влиять распределение зарядов по полипептидной цепочке. Показано, например, что обработка рибонуклеазы малеиновой кислотой снижает количество связывающегося с ней ДДС-Na с 1,9 до 0,3 г на 1 г белка. Такая обработка не изменяет заметным образом молекулярной массы рибонуклеазы, но вносит отрицательный заряд карбоксила на место положительного заряда аминогруппы. С другой стороны, на связывании ДДС-Na с лизоцимом обработка малеиновой кислотой никак не сказывается [Tung, Knight, 1972]. Ненормальное связывание ДДС-Na может быть также обусловлено необычной обогащенностью белка какой-либо гидрофильной аминокислотой. Гликопротеиды хуже связываются с ДДС-Na, чем чистые белки.

Разной степенью связывания ДДС-Na, по-видимому, следует объяснить и успешное разделение ?- и ?-цепей глобина кролика электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ с ДДС-Na. Различие молекулярных масс этих цепей (15?419 и 16?000) вряд ли само по себе могло бы обеспечить это разделение (Wood, Shaeffer, 1975]. Недавно было показано, что единственная мутационная замена аминокислоты (Арг?Цис) в белке с молекулярной массой 26?000 приводит к кажущемуся изменению этой величины на 1000. Существенно отметить, что такое изменение связано с заменой только одного из нескольких остатков аргинина, входящих в состав белка. Следовательно, в этом случае играет роль еще и окружение аргинина [Noel et al., 1979].

Рассмотренные примеры не могут дискредитировать плодотворный метод определения молекулярной массы белков электрофорезом с участием ДДС-Na. Они лишь указывают на необходимость некоторой осторожности и критичности в оценке результатов эксперимента, особенно с малоизученными белками.

Выбор пористости геля

При данной пористости (концентрации) геля описанная выше линейная зависимость имеет место только для белков, молекулярные массы которых лежат в определенном интервале. Слишком крупные для данного геля белки, очевидно, вовсе не смогут мигрировать в нем. Подвижности слишком малых белков, для которых поры геля практически не создают препятствий, будут зависеть не от их молекулярной массы, а только от отношения заряда к массе. Как указывалось, в присутствии ДДС-Na это отношение одинаково для большинства белков. Для ориентировки можно назвать некоторые цифры. Так, для одинаково сшитых гелей (С?=?3,3) были рекомендованы следующие значения Т в зависимости от молекулярной массы белков (M) [Dunker, Rueckert, 1969]:

Фирма BDH для своего стандартного набора белков-маркеров в интервале М 56?—?280 тыс. дальтон предлагает использовать гели с T?=?3,3, а в интервале 14?—?72 тыс. — с T?=?10; в обоих случаях С?=?2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миграции биополимеров в слабосшитых гелях с С2,6 быстро ослабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. Повидимому, в этом случае ярко проявляется способность жесткого комплекса белок?—?ДДС-Na раздвигать гибкие, слабосшитые нити акриламида.

Для определения молекулярных масс пептидов та же фирма выпускает набор стандартных фрагментов миоглобина с диапазоном М 2,5?—?17 тыс. Для него и соответствующих пептидов рекомендуется использовать сильно сшитый гель (Т?=?12,5; С?= =?9), содержащий 8 М мочевину, которая усиливает торможение малых пептидов в геле.

О важности правильного выбора пористости геля можно судить из сопоставления двух картин разделения набора из семи маркерных белков (рис. 19) [Fehrnstrom, Moberg, 1977]:

Разделение вели в приборе «Мультифор», использовав 5%- и 10%-ный ПААГ. Легко видеть, что в 5%-ном геле миоглобин движется почти с такой же скоростью, как и цитохром с. При перенесении результатов этих опытов на графики (рис. 20) получается, как и следовало ожидать, что точка, отвечающая по ложению цитохрома с в 5%-ном геле, выпадает из прямой линии, проходящей через все остальные точки, тогда как для 10%ного геля она оказывается на такой прямой.

Присутствие мочевины и неионных детергентов

Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины оказывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует вводить в гель. Мочевина вносит конформационные изменения в структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связывания ДДС-Na, так и на характер миграции комплекса белок?— ДДС-Na в геле еще не изучено.

Из аналогичных соображений следует удалять из белкового препарата перед его обработкой ДДС-Na другие детергенты, в частности неионные. Иногда это удается добиться за счет внесения в препарат еще большего избытка ДДС-Na, с тем чтобы он вытеснял неионный детергент из связи с белком, образуя с ним свободно растворенные смешанные мицеллы. Такие мицеллы могут «уходить» от комплекса белок?—?ДДС-Na, быстро мигрируя в электрическом поле [Nielsen, Reynolds, 1978]. Широко используемый для растворения мембранных белков Тритон Х-100 сильно мешает проведению электрофореза в ПААГ с ДДС-Na. Его можно извлечь из белкового препарата экстракцией хлороформом. Чтобы предотвратить выпадение плохо растворимых белков в осадок, перед экстракцией к препарату следует добавить ДДС-Na до 1%, который в хлороформ не переходит [Horikawa, Ogawara, 1979].

Выбор рабочего буфера геля

Из изложенного ясно, что рН буфера в этом варианте электрофореза не играет существенной роли, так как заряд белка определяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионерской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто используют 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,1. Его концентрация обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве последнего берут 0,01 М Na-фосфат, рН. 7,1. Как уже указывалось, такое различие обеспечивает концентрирование исходной полосы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однако ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера напряженность поля приходится ограничивать значением 5?В/см, что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфатного имеет смысл использовать другой, менее проводящий буфер, например имидазолфосфатный, рН 7. Молярность рабочего буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препарата концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить напряженность поля и сократить продолжительность электрофореза.

В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер, что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрации 0,1%. Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля одно время оспаривалась [Stoklosa, Latz, 1974]. Авторы цитируемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофореза. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходимость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел ка, последний будет терять ДДС-Na и изменять свою подвижность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было предложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной обработки ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом авторы сначала вели электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризованном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7) с 0,1% ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быстрой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло уже по заряду белков. При этом рН буфера можно с самого начала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделения, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na рН роли не играет.

Подготовка белкового препарата

На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопоставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции можно только в том случае, когда есть уверенность в полной денатурации белка при обработке его ДДС-Na.

Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против 0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% ?-меркаптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации ДДС-Na и ?-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация белка при этом должна составлять около 1 мг/мл [Weber et al., 1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз, прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитическую активность в .присутствии 1% ДДС-Na, но прогрев при 100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Рогtci, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюдается неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100° можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нанесением препарата на гель в него дополнительно добавляют ?меркаптоэтанол до концентрации 4?—?5%.

Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода рекомендуют при определении молекулярной массы малоизученного белка проверить полноту его денатурации. Для этой цели они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка по более сложной прописи, гарантирующей его полную денатурацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный ?-меркаптоэтанол с последующим алкилированием йодацетамидом). После этого формируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют картины электрофореза белка, обработанного обычным способом, и контрольного препарата.

С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеиды, при кипячении с 1?% ДДС-Na и 1?% ?-меркаптоэтанола могут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях приходится уменьшать концентрацию ?-меркаптоэтанола или не вводить его совсем.

При повышенной температуре иногда обнаруживается усиленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация белка многократно увеличивает его доступность для атаки протеолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эффективных ингибиторов. Если опасность протеолиза существует, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300?мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).

Проведение электрофореза

Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то здесь остаются в силе все те соображения, которые были приведены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропроводность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электрофорез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень сильно зависит от температуры). При длительном электрофорезе электродные буферы следует обновлять.

Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимодействие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности определения молекулярной массы малых белков и олигопептидов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8?М мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля. В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8?М мочевины при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая линейная зависимость lg?M от Rf [Kato et al., 1975], однако точки для инсулина (М=5782) и глюкагона (M?=?3483) из графика этой зависимости выпадали.

Разделение улучшается в случае малых исходных количеств белка (1?—?5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции около 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соответствующего набора стандартных маркеров. Затем следует поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в гелях с различным содержанием акриламида.

В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка честве стандартных маркеров в интервале М 12?—?200 тыс. дальтон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно при М?>?70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому фирма BDH при разработке своих стандартных наборов маркеров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на основе только одного белка с хорошо известным значением М, сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971]. Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и данзилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фиксировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru