Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расчетом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не за держивались пузырьки воздуха. Для этой цели торцы зубцов предварительно смачивают, потерев их о стекло с налитым на него раствором акриламида. В тех случаях, когда готовят двухслойный гель, по окончании полимеризации нижнего геля воду отсасывают, поверхности промывают буфером верхнего геля, заливают этот последний и уже в него устанавливают гребенку.

Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле.

В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На границе между двумя слоями разной пористости полоса исходного препарата будет выгодным образом сужаться.

Перегородки между близко расположенными карманами в агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Описан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пластинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ширине интервалов между перегородками, так что форма оказывается уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув форму, заливают агарозу с противоположной стороны. После застывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов оказываются разделенными перегородками из плексигласа, концы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].

Для получения пластин с градиентом пористости геля по высоте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом случае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь мономеров малой концентрации, а резервуар — более концентрированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить градиента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимеризующемся геле.

Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка трубок. Фирма «Pharmacia» (Швеция) предлагает для этой цели специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акриламида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установлена только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в лаборатории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не градиентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми прокладками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обрезают [Kerckaert, 1978].

Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров разной концентрации путем многократного переворачивания пластины или трубок в наклонном положении.

В литературе описано много конструкций приборов для электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предлагают различные фирмы. Наибольшее распространение получила конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером (рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между которыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера. Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма «Bio-Rad» в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструкцию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой прокладки.

В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично погружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах (фирмы. «Pharmacia») Рис. 9. Прибор Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Studier, 1973] оказывается приподнятым над дном резервуара. После погружения надо внимательно проверить, не осталось ли между пластинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить струёй жидкости из согнутой иглы шприца.

Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять препаратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на полную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.

Недавно был предложен очень простой, целиком (включая пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wilсе, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон электродным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно перемешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла, теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно слабого сцепления ПААГ с плексигласом.

Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара. Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют за счет трения в прорезях прокладок («Bio-Rad», «Pharmacia») либо прижимают к ним шлифованными торцами («Desaga»). В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, поэтому приходится ограничиваться использованием фирменных пластин и гелей определенной толщины.

Необходимость интенсивного теплоотвода от большой поверхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в прибор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов. Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказывается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта температура оказывается практически одинаковой по всему его сечению. Именно это обстоятельство является решающим для обеспечения хорошего качества разделения.

В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fiers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах. Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во всех случаях аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом несколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего через гель (см. ниже).

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пластинами со стороны карманов и слегка поворачивают. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала пройти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, наблюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно проникает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с пластины за «нерабочий» конец, лучше все же работать в перчатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может оставить на геле артефактное белковое пятно. При авторадиографии влажный гель, лежащий на одной пластине, можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.

Горизонтально расположенные пластины

Преимущество такого расположения — не только в компактности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель. Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла от пластинки геля — в его каналах циркулирует охлаждающая вода.

Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке, помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от его края. Электрическая цепь замыкается через 8?—?10-слойные фитили из фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в электродные резервуары, а другим — прижатые к гелю с перекрытием в 10?—?12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель следует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей между ними.

Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на аноде образуется свободная кислота, а на катоде — щелочь, которые по плотности отличаются от электродных буферов, а это может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч, электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются — и буфер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе «Мультифор» (LKB, Швеция) циркуляция буфера не предусмотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.

Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую иногда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в случае существенного охлаждения от конденсации на его поверхности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фитилей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия наблюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по конструкции приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) по периметру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке, оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фитилей используется специально обработанная целлюлоза с повышенной влагоемкостью.

Рис. 10. Схема прибора «Мультифор» для электрофореза в горизонтальных пластинах (фирмы LKB) 1?—?антиконденсационная крышка; 2 — электродный резервуар; 3?—?колодец для внесения препарата; 4?— гель; 5?—?фитиль; 6?—?охлаждающий столик Рис. 11. Наложение фитилей на гель в приборе «Мультифор» Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в коной крышки лодцы геля Описанные приборы не предъявляют строгих требований к качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ для прибора «Мультифор» ведут в форме, уплотненной по всем четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1?мм) и толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается во время электрофореза. Пластину из плексигласа после полимеризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесения препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для «Мультифора» — 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разливался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микрошприцем (рис. 13).

При сборке формы на стеклянную пластину накладывают еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажимают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаивать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать фильтровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее следует охладить в холодильнике.

Перед использованием ПААГ желательно выдержать не менее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание подсыхания. Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na), не следует хранить в холодильнике, так как ДДС-Na может выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на охлаждающий столик следует налить на него несколько миллилитров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл провести на столике водонесмываемым фломастером две линии на расстоянии примерно 15?—?20 мм от каждого из противоположных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно уложить края фитилей, что немаловажно для создания в геле однородного электрического поля.

Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером препарата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает распределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в препарат 10—20% глицерина.

После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на металлическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить.

Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2?—?4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно простое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.

При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе используют относительно большие токи, которые могут нагревать фитили из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать тоже из агарозы — заливкой ее 1?—?2%-ного раствора в специальные камеры; описаны конструкции соответствующих приборов [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980]. На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов. В приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) фитилями из 0,5% Рис. 14. Прибор для препаративного горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле с агарозными фитилями 1 — электродные резервуары; 2 — форма для заливки агарозы; 3 — съемные перегородки; 4 — гребенка ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мостики, на которых можно вести препаративный электрофорез ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.

Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата описано приготовление гелей для горизонтального электрофореза толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушивания такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже меченных 3H препаратов [Amaldi, 1972].

Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель размером 30???50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали на металлический охлаждающий столик самодельного прибора, накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности прижимали к столику давлением наполненной воздухом подушки [Kutateladze et а1., 1979].

Глава 3. Электрофорез белков

В двух предыдущих разделах были детально описаны практические приемы подготовки и проведения опытов по электрофорезу. Это позволяет приступить к подробному анализу, систематизации и сопоставлению физической сущности и потенциальных возможностей многочисленных и разнообразных вариантов этого метода, развитых за последние годы. В главах 3 и 4 мы попытались представить более или менее целостную картину бурного развития электрофоретических методов исследования белков и нуклеиновых кислот по состоянию на середину 1980 г. Главная задача изложения — выяснение существа и возможностей каждого из рассмотренных ниже вариантов. Однако следует еще раз подчеркнуть абсолютную необходимость совершенного овладения описанной выше техникой эксперимента, без которой попытки реализации самых блестящих замыслов заранее обречены на провал.

Из множества рассмотренных ниже экспериментальных работ в интересах экономии места и концентрации внимания на главном будут взяты только самые существенные количественные данные. Не следует пытаться по ним воспроизвести эти работы — для этого необходимо тщательно изучить цитируемый первоисточник.

Рассмотрению конкретных вариантов в обеих главах предпосланы довольно подробные замечания общего характера, которые постоянно следует иметь в виду при анализе и сопоставлении этих вариантов.

Замечания общего характера

Миграция белков в геле

Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в свободной жидкости (uо), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, обусловливающим отличие и' от uо является сила трения о гель, которая зависит от соотношения линейных размеров макромолекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляющего большинства индивидуальных белков не превышают 500?000. Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесообразным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести только по величине отношения заряда к массе. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5?—?20% акриламида.

Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим. Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэтому в большинстве случаев нецелесообразно использовать экстремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленные от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать слабокислые буферы (рН 4?—?5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода к катоду.