MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

При определении молекулярной массы коллагена использование глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том случае, если строить график зависимости от расстояния миграции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипептидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Скорость миграции зависит именно от размера молекулы белка — переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глицина, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].

Окрашивание и элюция белков

Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах, но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с использованием ДДС-Na, сделать именно здесь После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашивают, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-250 (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника AG 501???8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Однако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Для малых белков фиксация при окрашивании может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать предварительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и препятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, поэтому его целесообразно включить в фиксирующий белки раствор.

Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в 0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распределение между жидкой фазой и белками в пользу последних. Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски несколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ниже будут оценены возможности повышения ее чувствительности с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхлорид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь уместно отметить, что их присоединение к белкам исходного препарата не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.

Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из подробно рассмотренных ниже способов, в частности повторной элюцией из кусочков геля встряхиванием в течение 6?—?12 ч при 37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с 0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя бикарбонат, и растворяют в воде до 0,1 исходного объема. Затем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный, как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объема, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната аммония с 6 М мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции белка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Dowex 1???2 (200?—?400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером. Мочевину затем удаляют диализом.

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подавляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение исходной белковой полосы можно получить просто за счет разбавления буфера, в котором вносится препарат. Больший интерес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот прием будет рассмотрен ниже.

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно использован для фракционирования белков хроматина без их предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% ?-меркаптоэтанола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч?—?против свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще 2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесятеро меньше ДДС-Na и (?-меркаптоэтанола. При такой обработке ДНК отделяется от белка и не мешает протеканию последующего электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].

Ступенчатый электрофорез (dISc-electrophoresIS)

Отличительной особенностью этой системы является полимеризация в одной трубке или пластине двух гелей: рабочего, мелкопористого, и непосредственно над ним — «формирующего», крупнопористого. Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Отсюда и название системы — ступенчатый электрофорез. По-английски его сокращенно называют «disc-electrophoresis» (от слова «discontinuous»—прерывистый). Этот вид электрофореза был предложен Орнстейном и Дэвисом еще в самом начале становления метода электрофореза в ПААГ [Ornstein, Davis, 1964].

Пористость, длина и выбор буфера для нижнего (рабочего) геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза. Единственное, что здесь своеобразно—это обязательное использование в составе рабочего буфера быстроподвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки, например: иона Cl- для щелочных буферов или иона К+—для кислых. Выше отмечалось, что использование таких ионов невыгодно, так как приводит к ограничению напряженности поля и скорости миграции белков. Однако в данном случае использование «быстрых» ионов диктуется самим существом метода, как это будет ясно из дальнейшего изложения. Заметим, кстати, что если концентрация этих ионов и зависит от рН буфера, то их электрофоретическая подвижность от рН совершенно не зависит.

В формирующем геле небольшой протяженности (1—3 см) фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение этого геля—собрать смесь всех белков перед переходом в рабочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может составлять сотые доли миллиметра независимо от первоначального объема препарата. Для рабочего геля она является исходной зоной для фракционирования, а это резко повышает его разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сделать минимальной (Т=2,5—3). Формирующий гель полимеризуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель (следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), однако по концентрации и значению рН эти буферы не одинаковы. Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный, буфер рабочего геля — щелочной или кислый. Смысл этого различия будет раскрыт ниже.

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем («верхнего» буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). В этом буфере подвижность иона, мигрирующего в том же направлений, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы, например простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97). При этом диссоциации карбоксила с потерей протона и появлением отрицательного заряда соответствует pKa1=2,34, а ионизации концевой аминогруппы с присоединением протона и образованием положительного заряда—рКa2=9,6. При рН 5,97 все молекулы глицина ионизированы по обоим концам и их суммарный заряд равен нулю.

При сдвиге рН окружающей среды в щелочную сторону происходит нейтрализация части молекул глицина по аминогруппе, в то время как карбоксильные остатки всех молекул сохраняют свой отрицательный заряд. Процесс этот—чисто статистический, и для каждой отдельной молекулы можно говорить только о большей или меньшей вероятности того, что она превратится в отрицательный ион или останется нейтральной. В совокупности же множества молекул при данном рН заряд будет нести вполне определенная их доля. При незначительном сдвиге рН от изоэлектрической точки, например при рН 6,8, эта доля будет очень мала. При рН=рКa2 (9,6), согласно определению рК, уже половина всех молекул должна быть нейтрализована по аминогруппе и, следовательно, заряжена отрицательно. Для фигурирующих ниже значений рН 8,3 и 8,9 количество отрицательных ионов глицина будет меньше 50%, но все-таки значительным.

Описанные изменения доли заряженных молекул глицина (или аланина) используются в системе ступенчатого электрофореза. Для разных ступеней используют разные буферы, содержащие, однако, в своем составе одно и то же слабое основание или слабую кислоту, обеспечивающие собственно буферный эффект: в щелочной буферной системе, где удобно фракционировать кислые белки, это может быть Трис, а в кислой системе для разделения гистонов—уксусная кислота.

Рассмотрим для примера щелочную систему Орнстейна и Дэвиса (рис. 21). Верхним буфером служит 0,005 М Трис, титрованный добавлением глицина до рН 8,3. Глицин по отношению к Трису выступает в роли слабой кислоты. Для достижения рН 8,3 концентрацию глицина приходится довести до 0,038 М. При рН 8,3, как мы видели, значительная доля его молекул должна быть заряжена отрицательно, что обеспечивает хорошую электропроводность верхнего электродного буфера.

Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в 0,0625 М Трис-HCl, рН 6,8. В таком же буфере вносят и препарат (с добавкой, как обычно, до 10% глицерина или сахарозы). Первоначально электропроводность этого буфера будет тоже высокой благодаря ионам С1-. Их концентрация при рН 6,8 достаточно высока (см. выше).

Наконец, рабочий гель полимеризуют в 0,375 М Трис-HCl, рН 8,9. Обращает на себя внимание высокая концентрация буРис. 21. Схема ступенчатого электрофореза А — перед включением напряжения; Б — момент концентрирования препарата в тонкую исходную полоску; В — фракционирование белковых зон фера, необходимая по двум причинам. Во-первых, при рН 8,9 буферная емкость Трис-НСl уже мала, а в этом буфере должны мигрировать сконцентрированные белковые полосы. Во-вторых, относительное содержание ионов С1- при таком значении рН невелико, и для обеспечения необходимой электропроводности концентрацию буфера приходится увеличивать. Нижний электродный буфер существенной роли не играет. Например, можно взять 0,1 М Трис-HCl, рН 8,1.

Теперь рассмотрим процессы, протекающие в этой системе после включения электрического напряжения. В первый момент напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступенях системы и начнется переход белков из буфера препарата в формирующий гель. В это же время в верхней части формирующего геля начнет развиваться новая ситуация. Под действием поля ионы Cl- будут быстро уходить в направлении рабочего геля, а на их место из электродного буфера будут поступать ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с рН 6,8. При этом, как следует из изложенного, большинство молекул глицина восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и перестанет участвовать в проведении тока. Сопротивление буфера препарата, а за ним и верхней части формирующего геля резко возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. He многочисленные при рН 6,8 заряженные молекулы глицина ускорят свое движение к аноду, обеспечивая непрерывность электрического тока по всему гелю.

Неправильно представлять себе дело так, что только малое число молекул глицина будет мигрировать в поле, а остальные останутся на месте. Состояние диссоциации-ассоциации аминогрупп—это статистическое равновесие, захватывающее всю совокупность молекул глицина, находящихся в растворе. Поэтому все они (рывками) будут мигрировать в направлении анода, но в каждое мгновение электрический заряд будет переносить лишь небольшое число молекул, заряженных именно в это мгновение. Но вернемся к событиям, развивающимся в геле.

Мы видели, что в верхней части формирующего геля возникает область повышенной напряженности поля, в которой оказываются и успевшие перейти в гель белки. Естественно, что они мигрируют в ней относительно быстро. Так же быстро идет переход белков из буфера препарата в формирующий гель. Впрочем, белки мигрируют все же медленнее, чем ионы глицина, так как отношение заряда к массе у белков меньше. Описанные явления постепенно распространяются на весь формирующий гель. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого геля. Вплотную за ними к границе с рабочим гелем подходит глицин. Теперь весь формирующий гель находится в зоне повышенной напряженности поля. В этом поле ускоренно движутся белки, уже перешедшие из исходного раствора препарата в формирующий гель. Никакого их концентрирования пока не происходит; оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие молекулы белка достигнут границы рабочего геля. Тем временем линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в рабочий гель, где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напряженности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина оказываются при рН 8,9, который обеспечивается степенью ионизации и высокой концентрацией Триса. При этом рН большая часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ионы. Эти нейтральные молекулы оказались в рабочем геле в силу статистического характера миграции глицина, который был описан выше. Электропроводность Трис-глицинового буфера в верхней части рабочего геля оказывается столь же высокой, как и Трис-НСl (этого добились подбором рН 8,9 и концентрации всех компонентов системы). Напряженность электрического поля в рабочем геле соответственно остается низкой, и это обстоятельство играет решающую роль в концентрировании белков.

Впереди идущие молекулы белков достигают границы раздела и переходят в рабочий гель, где попадают в область низкой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает. Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в объеме формирующего геля, т. е. в области высокой напряженности поля, и движутся быстро. Потом и они входят в рабочий гель и почти останавливаются. Это происходит со всеми молекулами препарата. Находившиеся далеко сзади молекулы белка догоняют (почти догоняют) ушедшие вперед молекулы. Весь исходный препарат, каков бы ни был его начальный объем, в самом верху рабочего геля стягивается в тонкую полоску белков. Отсюда и начинается их медленная миграция в мелкопористом геле при щелочном значении рН, т. е. фракционирование белковой смеси. Между тем граница раздела ионов хлора и глицина уходит все дальше вперед, и через какое-то время весь рабочий гель оказывается в Трис-глициновом буфере примерно с тем же рН. Замена буфера не сказывается на разрешающей способности рабочего геля, а то обстоятельство, что фракционирование белков начинается с узкой исходной зоны, дает колоссальный выигрыш—разрешающая способность системы в целом резко увеличивается. Для полноты картины отметим, что заряженные ионы Трис+, участвуя в поддержании рН буфера, будут, замещая друг друга, медленно мигрировать вверх, в сторону катода. Ввиду малой подвижности этих ионов их вклад в электропроводность невелик.

Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко Представить себе и для кислого буфера рабочего геля. В качестве слабой («буферной») кислоты можно использовать уксусную, а роль быстро мигрирующего иона «поручить» К+. В качестве цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, берут??-аланин. Подбор количественного соответствия концентраций и рН дает следующую пропись для построения системы. Для получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор уксусной кислоты титруют КОН до рН 4,3. Буфер формирующего геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора уксусной кислоты до рН 5,8. Буфер верхнего электрода (анода) получают из 0,035 М водного раствора р-аланина, титруя его до рН 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что рН буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и настолько же ниже — для кислого).

Мочевину, детергенты (ДДС-Na, Тритон Х-100 и Твин-80), а также ?-меркаптоэтанол или дитиотреитол можно вводить в состав буферов обоих гелей, например: с целью растворения труднорастворимых белков или для защиты их от окисления.

Как уже упоминалось, ступенчатый электрофорез можно использовать и для разделения белков, находящихся в комплексе с ДДС-Na. Такая система была разработана Лэммли еще десять лет назад [Laemmli, 1970]. С тех пор она приобрела чрезвычайную популярность. Хотя выше и было высказано некоторое сомнение в том, что ее использование всегда оправдано, система заслуживает подробного описания.

В качестве рабочего геля в ней используют 10%-ный ПААГ, формирующего—3%-ный; для обоих гелей С=2,6. Буфером рабочего геля, как и у Ористейна и Дэвиса, служит 0,375 М Трис-НСl (рМ 8,8) с добавлением ДДС-Na до 0,1%. Попутно отметим, что 0,1%-ный ДДС-Na не препятствует развитию бактериальной флоры при комнатной температуре, поэтому его надо хранить на холоду. Электрофорез ведут в трубках диаметром 6 мм и длиной 15 см. Рабочий гель полимеризуют на длину 10 см, формирующий—на 1 см. Для формирующего геля Лэммли использовал буфер вдвое большей концентрации, чем Орнстейн и Дэвис (0,125 М Трис-HCl, рН 6,8, с 0,1% ДДС-Na). Для полимеризации в оба геля он вносил по 0,025% персульфата аммония и ТЕМЕД. Верхний электродный буфер Лэммли содержал Трис впятеро более высокой концентрации, чем цитировалось выше (0,025 М), титрованный глицином до той же величины рН (8,3), чему соответствовала и впятеро более высокая концентрация глицина (0,192 М). 0,1% ДДС-Na присутствовал и в этом буфере.

Белковый препарат (0,2—0,3 мл) вносят в 0,0625 М ТрисНС1 (рН 6,8), содержащем 10% глицерина и 0,001% бромфенолового синего. В препарат добавляют ДДС-Na до 2% и ?-меркаптоэтанол до 5%, а затем прогревают его в течение 1,5 мин на кипящей водяной бане. Цель такой обработки была указана выше. Если исходный белковый препарат имеется в виде осадка, то его следует сначала растворить в буфере, а потом уже добавлять ДДС-Na из концентрированного раствора. В противном случае на поверхности осадка комплекс белок—ДДС-Na может образовать корку, препятствующую его полному растворению [Maizel, 1971].

Электрофорез при силе тока 3 мА на трубку занимает 7 ч. Фиксацию белков в 50%-ном растворе ТХУ ведут в течение ночи, окрашивание свежеприготовленным 0,1%-ным раствором СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ—в течение часа при 37°. Избыток красителя из геля вымывают диффузией в 7%-ной уксусной кислоте.

Система Лэммли так же успешно используется для электрофореза в пластинах ПААГ. Для иллюстрации на рис. 22 показано расположение полос при сопоставлении субъединичного состава трех РНК-полимераз амебы [D'Alessio et al., 1979]. Хорошо видна высокая степень разрешения близких по молекулярной массе полипептидов. Иногда ступенчатый электрофорез по Лэммли используют в сочетании с градиентом пористости рабочего геля, что еще более повышает разрешающую способность метода [Mahadik et al., 1976]. В случае угрозы агрегации, например при фракционировании кислых белков хроматина, в оба геля системы Лэммли можно ввести мочевину [Wilson, Spelsberg, 1975].

Имеются подтвержденные данные о том, что система, предложенная Лэммли, чувствительна к качеству ДДС-Na [Swaney et al., 1974; Matheka et al., 1977]. Препараты, полученные от одних фирм («Pierce», «Matheson, Coleman and Bell»), дают хорошие результаты, в то время как с другими препаратами ДДСNa (BDH, «Serva») разрешение получается плохое, а белки менее подвижны. Этот эффект зависит и от того, какие белки разделяются. Для других буферных систем он не наблюдается, но белки разделяются в них зачастую вообще хуже, чем в системе Леммли. Природа описанного эффекта непонятна. По-видимому, при высокой концентрации Триса связывание ДДС-Na с белками зависит от молекулярного состава детергента. Анализ методом газовой хроматографии показывает, что продажные препараты ДДС-Na неоднородны. В них может содержаться до 10% примесей, имеющих значительно больше чем 12 атомов углерода на молекулу.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru