MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

?-Меркаптоэтанол в концентрации 1?—?5% нередко вносят в исходный белковый препарат для предохранения его от окисления и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энергичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей и разделением белковых субъединиц производят путем нагревания белкового раствора до 90?—?100° в присутствии не только ?меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.

В некоторых случаях при использовании боратного буфера или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), возможно образование комплексов компонентов буфера с белками. Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколько иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые полосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно повторным электрофорезом. В силу равновесного характера процесса образования комплексов каждая из двух полос дублета при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две полосы.

В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на способ их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых случаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофореза через гель пропускают такие связывающие их соединения, как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или гидрохинон.

При фракционировании очень малых количеств белка может оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазываются» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исходный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Проходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.

Лидирующие красители

Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться с белками, а скорость его продвижения по гелю должна быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало использование большей части находящегося в них геля для фракционирования белков. Быть может, по ассоциации с велосипедными гонками за лидером, этот краситель называют лидирующим («tracker dye»).

В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных остатка. Иногда используют еще более сложно построенный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвижность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового синего, поэтому его используют при фракционировании крупных белков и нуклеиновых кислот.

Для характеристики электрофоретической подвижности белка в данных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf.

В качестве положительно заряженного красителя для электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении катода, используют метиловый зеленый или пиронин.

Разделение белков по размерам и заряду

В этом случае в электродных резервуарах и для полимеризации ПААГ используют один и тот же буфер, поэтому такую систему иногда называют непрерывной, или простой. Строго говоря, непрерывность нарушается тем, что буфер, в котором вносят белковый препарат, с целью концентрирования исходной зоны разбавляют в 5?—?10 раз водой.

Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к выбору следующих параметров: пористости геля и степени его сшивки, т. е. значений Т и С (см. главу 1); природы, концентрации и рН буфера; диссоциирующих добавок (если это необходимо); максимально допустимой мощности, напряжения и силы тока, а также продолжительности разделения; объема и концентрации исходного препарата; процедуры предварительной обработки препарата.

Выбор значений T и С в зависимости от молекулярных масс разделяемых белков был подробно обоснован в главе 1. Чаще всего с белками работают при T?=?3,5?—?20 и C?=?1?—?3.

Выбор рабочего буфера

Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности и сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных электрических зарядах белков выбирают рН буфера, отличающийся на 3?—?4 единицы от среднего значения рI для белков данного типа. Если эти значения неизвестны, то желательно составить себе представление о характере зарядов белков при различных рН по характеру их сорбции на ионообменных смолах.

Для кислых белков часто используют буфер с рН 8,9, для щелочных — с рН 4,3?—?4,5. В качестве слабощелочных буферов для кислых белков применяют Трис-HCl, Трис-глициновый, Трис-боратный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков чаще всего используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы, а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную кислоту в концентрации 0,9 М или 5% (0,9 М СН3СООН имеет рН?2,4; 0,1?М?—?рН?2,87). О преимуществах буферов, не содержащих легко подвижных ионов (С1–, К+), было сказано выше.

Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более высоких значениях напряженности возможны искажения формы белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, например, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см2. Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении 120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно используют меньшие величины тока — около 3 мА на трубку. Для вертикальной пластины размером 10???14 см и толщиной 1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбранных систем оказываются не очень значительными, так как для любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция — использовать максимально возможную напряженность поля при максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности тока.

В двух приведенных простейших примерах напряженность поля в геле можно рассчитывать просто путем деления напряжения, указываемого источником тока, на длину геля. При этом пренебрегают падением напряжения в электродных резервуарах — на участке цепи между электродами и гелем. В том случае, когда электродные буферы находятся в непосредственном контакте с гелем, это вполне допустимо.

Иначе обстоит дело в приборах с горизонтально расположенными пластинами. Например, для электрофореза в приборе типа «Мультифор» при ширине пластины 20 см и толщине геля 1 мм плотности тока 20 мА/см2 соответствует его сила 40 мА. Падение напряжения в самом геле длиной 10 см при напряженности поля 15 В/см составит, очевидно, 150 В. Однако напряжение, которое надо установить на источнике тока, должно быть существенно выше ввиду значительного падения напряжения на фитилях, соединяющих буферные резервуары с гелем. Это падение напряжения трудно оценить, поэтому для выяснения значения напряженности поля в самом геле прибор «Мультифор» снабжен специальным вольтметром, измеряющим падение напряжения между двумя точками поверхности геля, находящимися на определенном расстоянии друг от друга. В рассмотренном примере использовали Трис-глициновый буфер с довольно высоким элект рическим сопротивлением. Мощность, расходуемая в приборе «Мультифор», в этом случае составит всего лишь 6 Вт (150?В?? ??0,04 А). Иная картина получится, если тот же гель заполимеризовать в 0,1 М Na-фосфатном буфере с рН 7,1. Электропроводность этого буфера довольно высока за счет легко подвижных ионов Na+. Измерения в том же приборе показывают, что уже при напряженности поля 5 В/см (падение напряжения?—?50 В на пластину) плотность тока в геле возрастает до 100 мА/см2. Если довести напряженность поля в геле до 15 В/см, то сила тока через пластину сечением 2 см2 (20???0,1 см) составит 600 мА. При падении напряжения на геле, равном 150 В, это привело бы к совершенно неприемлемому уровню тепловыделения (мощность 90 Вт). Однако дойти до этого режима практически невозможно ввиду большого падения напряжения на фитилях, их разогрева, обсыхания и дальнейшего увеличения сопротивления. В итоге, при работе с фосфатным буфером приходится ограничивать силу тока (~200 мА) и работать при пониженных значениях напряженности электрического поля. Соответственно увеличивается и продолжительность электрофореза.

Еще раз подчеркнем, что электропроводность любого буфера определяется не только концентрацией, но степенью и характером его ионизации (близостью рН к рKa буфера и подвижностью образующих ионов). Концентрации рабочих буферов в пределах 0,05?—?0,1 М можно считать ориентировочно нормальными, хотя для слабо ионизированных буферов, используемых вблизи границы их буферной области, можно встретить в литературе и более высокие значения концентрации — вплоть до 0,4 М.

В непрерывной системе сопротивление геля не должно заметным образом изменяться в процессе электрофореза. Как следствие этого, не должна изменяться и расходуемая мощность. Повышение напряжения источника, работающего в режиме постоянного тока, или уменьшение силы тока при постоянном напряжении говорят о каких-то неполадках в электрической цепи, например: о высыхании фитилей или нарушении контактов между ними и гелем.

Использование мочевины

Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации от 2 до 8?М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый препарат. В электродные буферы вносить мочевину не нужно, так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а следовательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводности буфера присутствие мочевины практически не сказывается. Однако под влиянием нового окружения могут изменяться рК отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность белков.

В концентрированных растворах мочевины происходит денатурация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и полипептидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как хаотический клубок. Денатурация не является полной и может быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе этой концентрации иногда приходится искать компромисс между опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой денатурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим только, что образование цианата в растворах мочевины идет ускоренно при щелочных рН, поэтому щелочные буферы с добавкой мочевины следует использовать сразу после их приготовления.

Для составления геля пользуются обычно «маточными» растворами повышенной концентрации. Удобно, например, приготовить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (T?=?40). Haпомним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мономеров к конечному объему их раствора, а С?—?отношение массы NN/-мeтилeнбиcaкpилaмидa к сумме масс двух мономеров. Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего геля параметры Т?=?10 и С?=?2,6, то при составлении маточного раствора можно взять T?=?40 и С?=?2,6. Практически это означает, что надо отвесить (40???2,6)/100?=?1,04 г метиленбисакриламида и 40?—?1,04?=?38,96 г акриламида и растворить их в воде до конечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае полезно проверить, что рН буфера сохраняется при соответствующем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных растворов мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.

Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объеме, который можно не учитывать. Для этого готовят концентрированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата, остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда можно пренебрегать. Выбор содержания персульфата аммония и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необходимость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля были подробно рассмотрены в главе 1, Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее добавляют во все маточные растворы. При растворении мономеров до Т?=?40 концентрацию мочевины приходится ограничивать значением 2?—?3?М. Зато маточный раствор буфера можно приготовить на 10?М мочевине и такой же концентрации раствор ее использовать для доведения до расчетного объема вместо воды.

Особо гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина, при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присутствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сначала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кислоте с 5 М мочевины [d'Abbis et al., 1979].

В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе сохранить ферментативную активность белка — либо для последующей его элюции и использования, либо для обнаружения с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстрата ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом случае концентрированного раствора мочевины является нежелательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить устойчивость фермента при выбранной величине рН рабочего буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина рН в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого щелочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].

Иногда следует проверить сохранность ферментативной активности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью разобщения фермента с другими белками или необходимыми для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить следующим образом: на разных стадиях электрофореза вырезать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответствующую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых условиях, проверять сохранение активности фермента, используя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее продукта — из геля.

Загрузка геля и подготовка препарата

Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем буфере, но меньшей концентрации (в 5?—?10 раз). По рассмотренным выше причинам это приводит к значительному сужению исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электрофорез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в разбавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфере геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из препарата; в противном случае эффект концентрирования белка при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен простой и остроумный способ диализа белкового раствора в капле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant, 1980].

Иногда проводят предварительное полное восстановление белка путем прединкубации его в течение ночи при комнатной температуре в буфере с рН 8,5?—?9, содержащем 0,1 М (?-меркаптоэтанола и 9 М мочевины (щелочное значение рН буфера способствует восстановительному эффекту ?-меркаптоэтанола).

В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или сахарозы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер (см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, например бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Миграция этой «лидирующей» зоны до конца геля определяет момент окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последующей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается. Если далее предполагается определение величины Rf, то положение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из формы следует отметить (например, вколоть в гель тонкую проволочку) .

Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. После внесения препарата в трубку или карман пластины на 5?— 15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое против расчетного. За это время лидирующий краситель должен полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия формирования исходной белковой полосы в геле. Затем переходят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе тока.

Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки белков после электрореза,как и способы определения радиоактивности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.

Некоторые примеры

Теперь для иллюстрации целесообразно привести некоторые примеры, отнюдь не отражающие всего безграничного разнообразия приложений электрофореза белков, даже в его простейшем, только что рассмотренном варианте.

Обзорный клинический анализ белков сыворотки человека. В приборе с горизонтальным гелем (типа «Мультифор») одновременно можно обследовать сыворотку крови 20 пациентов. Условия разделения: гель указанных выше размеров, T?=?3,5, С?=?2,6; 0,1 М Трис-глициновый буфер, рН 8,9; напряженность поля 15 В/см, сила тока 45 мА; температура охлаждающей воды 10°; преэлектрофорез в течение 30 мин при силе тока 60 мА. Препараты сыворотки разбавляют в отношении 1 : 3 тем же буфером, разведенным в 10 раз. Объем каждого препарата 5 мкл. В первые 10 мин электрофореза силу тока снижают до 20 мА. Скорость миграции бромфенолового синего 4,5 см/ч; общая продолжительность электрофореза 1,3 ч. На рис. 17, A сопоставлены картины фракционирования белков сыворотки 10 пациентов с различными заболеваниями (по два препарата от каждого). Крайние слева и справа пары треков содержат сыворотку нормальных доноров. Направление миграции белков — снизу вверх. Интенсивные пятна вверху — низкомолекулярные компоненты сыворотки.

Заметно лучше, особенно в области крупных белков, те же препараты разделяются в более концентрированном геле (T??=?7,5; С??=?2,6), однако в этом случае часть наиболее крупных белков выпадает в осадок на границе геля (рис. 17, Б). Скорость миграции бромфенолового синего 1,8 см/ч при рабочей силе тока 40 мА; продолжительность разделения 2,8 ч [Fehrnstrom, Moberg, 1977].

Фракционирование гистонов и других щелочных белков.

5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4?— 8 М мочевины часто используют для электрофоретического фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley, 1969]. Молекулярные массы гистонов лежат в диапазоне 11?—?22 тыс. дальтон, поэтому для их разделения используют мелкопористые гели (T?=?15?—?20). Положительно заряженные в кислой среде гистоны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в этой простой системе разделяются довольно плохо. От них заметно отстает относительно более крупный гистон H1. В качестве лидирующего красителя используют пиронин.

Недавно Спайкер описал систему фракционирования гистонов в двуступенчатом ПААГ с «кислой мочевиной». Основной рабочий гель?—?пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в 0,9 М СН3СООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М СН3СООК, рН 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напряжении — за 1?—?2 ч. Качество полос и их разрешение в такой системе сильно выигрывают [Spiker, 1980].

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru