MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержание

Для регистрации ?-излучения 125I удобно применять способ «непрямой» авторадиографии. ?-Излучение регистрируется рентгеновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и теряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый «интенсифицирующий экран», покрытый твердым сцинтиллятором (CaVO4). Под действием ?-излучения экран флюоресцирует, а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку экран удален от геля на толщину пленки, а не все ?-частицы вылетают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш в чувствительности получается значительный.

Для непрямой авторадиографии следует использовать экранированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R» и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирующие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Font» (США) под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфармзавод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.

Для повышения чувствительности пленки ее иногда предварительно засвечивают до плотности потемнения (после проявления), соответствующей A540=0,2—0,3. Объяснение этого странного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey, Mills, 1975].

Флюорография

Для регистрации положения в геле белков, меченных тритием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он находился в непосредственном контакте с радиоактивными белками в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгеновской пленкой того же типа, который используют при непрямой авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геометрических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.

Повсеместное распространение для флюорографии гелей получила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки. Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО), вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель переносят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде нерастворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова замещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна, но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате достаточно продолжительного экспонирования на пленке появляется картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле [Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре резко снижается чувствительность метода.

Гели с низким содержанием акриламида, например смешанные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в нем сжимаются.

Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу. К противоположной стороне геля во время сушки плотно прилегает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стекленеет»), а на противоположной его поверхности остается влага, которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во избежание этого дефекта было предложено между свободной поверхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой пористого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].

Недавно было указано на возможность замены ППО в качестве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979]. Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки. Главное же преимущество этого реагента — в его водорастворимости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюорографировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 недель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).

После флюорографии для количественных определений радиоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать, дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и далее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффекгивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться только методом внутренней стандартизации.

Для правильного совмещения изображения на рентгеновской пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперными отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают радиоактивными чернилами. С этой целью можно использовать любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впрочем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю авторадиографии влажных гелей, например при регистрации радиоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так существенно.

Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно регистрировать в геле двойную метку 3Н и 14С (например, сопоставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси вводят радиоактивную метку по 3Н, в белки второй — по 14С. Обе смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом. Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтилляцию от обеих белковых смесей (3H+14С). С негатива делают контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности оказываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют авторадиографией только 14С. К свету сцинтилляций эта пленка нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местонахождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении вырезать плоский слой толщиной 0,5—1,5 мм. Описано простое приспособление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].

Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенными на их «репликами» белков из геля осуществляют очень просто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высушивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую пленку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на поверхности фильтров.

Препаративныи электрофорез белков

Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения в качестве препаративного метода фракционирования и очистки белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности осуществления равномерного теплоотвода из большой массы геля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плоской). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле градиенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому ухудшению качества разделения белков.

Вторая трудность связана с необходимостью создания удобной и надежной камеры элюции для сбора белков по мере их последовательного выхода из геля. В многочисленных конструкциях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру создавали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохранения качества разделения белков камера элюции очень малого объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в камеру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.

Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодолеть указанные трудности. Препаративное фракционирование белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее подавался под гидростатическим давлением, уравновешивающим вес геля, а скорость элюции задавалась перистальтическим насосом, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделении ряда белковс молекулярными массами 100—500 тыс. при загрузке в гель 4 мг белка [Hardman, Kane, 1980].

Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полимеризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембраной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из них используется для подкачки, вторая — для слива элюирующего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое перемещение на очень малое расстояние вызывается кратковременной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так создается камера элюции: она существует только то время, которое необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается. Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, либо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры полярность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную, что помогает десорбции белков с мембраны.

Проще и надежнее вести элюцию заранее окрашенных белковых полос последовательно, одну за другой, в сменные диализные мешочки [Sun, Hall, 1974]. В цитируемой работе ПААГ полимеризовали тоже в цилиндре из плексигласа диаметром 3 см, по оси которого проходила трубка для дополнительного охлаждения геля циркулирующей водой. Гель высотой 21 см поддерживался снизу найлоновой сеткой. Сменные диализные мешочки легко одевались на нижний конец цилиндра с помощью полиэтиленовых переходников. Перед снятием очередного мешочка полярность напряжения на короткое время реверсировали. Таким образом авторам удалось выделить из 6 мг исходного белкового препарата три компонента, относительно мало различающиеся между собой по молекулярной массе (43, 47 и 53 тыс. яальтон).

Возможно построить препаративную систему электрофореза с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края пластины ПААГ. Фирма «Bio-Rad» предлагает для этой цели специальные прокладки, используемые при полимеризации геля. Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю рабочего геля толщиной до 6 мм по обеим его сторонам две трубочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков. Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочек и на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом замещает элюирующий буфер.

Для препаративного фракционирования белков нередко используют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и из несколько других соображений, чем создание узкой начальной полосы. Наличие дополнительного формирующего геля при большой загрузке предохраняет от преципитации белка на границе рабочего геля, позволяет увеличить объем препарата, обеспечивает удаление из него остатков соли до начала процесса рабочего разделения и, наконец, снимает необходимость преэлектрофореза, так как основная часть персульфата успевает уйти из рабочего геля к аноду до того, как в этот гель вступают белки. Максимальная загрузка ПААГ при препаративном фракционировании белков может достигать 5 мг на 1 см2 сечения геля.

Общим недостатком любых устройств с последовательной элюцией белков в конце пути их миграции через весь гель является продолжительность этого процесса и, в силу этого, диффузия белковых зон (особенно для белков, выходящих последними), поэтому сейчас на практике отдают предпочтение обычному (хотя и с увеличенной загрузкой) фракционированию белков в трубках диаметром до 1,7 см или в толстых пластинах. Фракционирование ведут с примесью окрашенных «свидетелей», как было описано выше. Аликвоту разделяемой смеси белков окрашивают ремазолом [Sun, Hall, 1974] или посредством данзилирования [Tijssen, Kurstak, 1979; Schetters, McLeod, 1979]; окрашенные полосы вырезают и белки элюируют из геля за счет диффузии или электрофореза (см. выше).

Следует иметь в виду, что при элюции белков из геля может выходить большое количество линейного полиакриламида, не вошедшего в состав матрицы геля. Он не обнаруживается при оценке чистоты белка аналитическим электрофорезом. Между тем аналитическое ультрацентрифугирование показывает, что количество элюированного полиакриламида может быть таким же, как и самого белка. Дополнительную очистку белка в этом случае можно провести его сорбцией на ионообменную смолу [Brooks, Sander, 1980].

Недавно был предложен оригинальный способ электрофоретической элюции белков одновременно из нескольких полос геля, вырезанных из пластины после препаративного электрофореза [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой .пропитанного буфером сефадекса Г-25 «суперфайн» толщиной 2—3 мм. С интервалом в 1—1,5 см перпендикулярно длинной стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укладывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут угольные электроды и подают напряжение. Под действием электрического поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежащий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в микроколонки и белки из них элюируют.

Кстати, можно просто заполнить сефадексом вертикальную колонку и использовать его в качестве антиконвекционной среды для препаративного электрофореза белков. Это, конечно, уже не электрофорез в геле, и качество фракционирования будет заведомо хуже, но для грубого разделения смеси белков оно может быть вполне приемлемым.

Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора сахарозы (10—45%) в буфере с рН 8,5. Электрофорез вели в цилиндре диаметром 12 см и высотой 17 см [Walters, Bont, 1979]. Тонкость метода — в наслаивании препарата на раствор сахарозы с помощью металлического сита, которое поднимается по мере увеличения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет нанести 30 мл исходного белкового препарата совершенно ровным слоем толщиной 3 мм. Электрофорез во избежание разогрева жидкости ведут при малой плотности тока (0,2 мА/см2) в течение 15 ч. Фракции собирают, сливая содержимое колонки через воронку, расположенную в ее нижней части. Препаративный электрофорез в 5—25%-ном градиенте сахарозы в 0,1 М Трисборатном буфере (рН 8) с 6 М мочевиной был недавно использован для очистки фотохимически сшитого комплекса тРНК и тРНК-синтетазы [Renaud et al., 1979].

К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого отношения не имеют, так как являются примерами электрофореза в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических целей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, различных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.), который широко применялся при фракционировании пептидов, аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биологически важных молекул, в том числе и в высоковольтных вариантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфере (рН 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором — на ДЭАЭбумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емкости ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гидролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные радиоактивным фосфором.

Сейчас методы фракционирования низкомолекулярных биологических объектов электрофорезом на твердых носителях настолько энергично и успешно вытесняет жидкостная хроматография под высоким давлением (ЖХВД), что рассматривать их уже не имеет смысла. Впрочем, изредка электрофорез на твердом носителе еще используют и для фракционирования белков. Так, сравнительно недавно было описано очень хорошее разделение девяти модификаций казеина молока электрофорезом на полосках ацетатцеллюлозы. Эти модификации различались уровнем фосфорилирования белка, и разделение шло по величине электрического заряда [West, Towers, 1976].

Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148 Использование жидкого (не сшитого) ПААГ……………………………………………….149 Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ...... 150 Элюция нуклеиновых кислот из гелей ............. 153 Элюция из ПААГ за счет диффузии ............ 153 Элюция из гелей агарозы ................ 154 Электрофоретическая элюция ............... 158 Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры и диазобумагу ..................... 162 Определение радиоактивности ................ 165 Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот ........ 166 Литература ....................... 168 Часть вторая УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ Введение ......................... 174 Глава 1 . Основные понятия теории седиментации ............ 175 Глава 2 Ультрацентрифуга ..................... 177 Принцип действия и расположение важнейших узлов ....... 177 Проверка готовности основных систем к пуску .......... 179 Пуск центрифуги ...... .............. 180 Глава 3 Роторы и пробирки .................... 182 Угловые роторы ....................... 182 Пробирки для угловых роторов .............. 184 Уход за роторами и пробирками .............. 187 Роторы со свободно подвешенными пробирками (бакет-роторы) . . . 189 Роторы с вертикальными пробирками ..........'... 191 Максимально допустимая частота вращения ротора ........ 191 Зональные роторы ..................... 193 Особенности эксплуатации и ухода ...'.......... 197 Глава 4 Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199 Глава 5 Зонально-скоростное центрифугирование ............. 201 Константа седиментации .................. 203 Изокинетический градиент плотности ............... 204 Выбор среды ............ ь .......... 206 Характеристики растворов сахарозы ............... 210 Профиль градиента сахарозы ................. 213 Создание градиента плотности сахарозы ............ 214 Наслоение препарата на градиент ........ i .... 219

<<< НазадСодержание

medbookaide.ru