MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90—95° около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником.

Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50?—?60°). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].

Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.

Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют агарозные гели с концентрацией 0,4?—?2%. Ниже для ориентировки представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования:

Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид 0,4 Рестрикты ДНК (5?—?20 тыс. пар оснований) 0,7 мРНК, денатурированная обработкой метилртутью 1,0 Реовирусная двунитевая РНК (500?—?5000 пар оснований) 1,5 Рибосомная РНК 1,75 Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100?—?1000 пар оснований) 2,0 Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в термостате при данной температуре. Это необходимо для полного выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем обеспечивается одновременное застывание всего геля и однородность его структуры.

Смешанный гель (агароза+пааг)

Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5?—?2,5% акриламида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют совместно с 0,5?—?0,6% агарозы. Имеет место своеобразный «симбиоз»: чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их комбинация образует гели с отличными механическими характеристиками.

Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризующийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоретическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас, придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образования такой структуры надо обеспечить условия, при которых агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Исходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония и ТЕМЕД.

Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего разбавления, прогревают, как описано выше, и выдерживают в течение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соответствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэрируют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно заливают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появлением границы, лежащей на 2?—?5 мм ниже края геля агарозы. Для обеспечения формирования узкой начальной полосы препарата при вступлении его в гель имеет смысл спустя час после окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пластину и обрезать гель ниже границы полимеризации акриламида. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель и за лить поверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и формировать «карманы» для внесения препаратов [Schwinghamer, Shepherd, 1980].

В качестве примера можно назвать успешное разделение путем электрофореза в смешанном геле (1,7% ПААГ?+?0,5 агарозы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishinaga, Yamamoto, 1980].

Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная пааг

Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопористую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акриламида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По окончании полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить и отмыть. Таким способом нетрудно получить «пластинку» толщиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от геля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Frenkel, Blagrove, 1978].

Глава 2. Техника приготовления гелей и аппаратура

Рассмотрим основные технические приемы приготовления и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналитического электрофореза: вертикального в трубках, вертикального в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препаративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к ним, а также условий протекания самого процесса электрофореза будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвященных описанию различных вариантов электрофоретического фракционирования белков и нуклеиновых кислот.

Вертикально расположенные трубки

Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни Рис. 5. Прибор для электрофореза в вертикальных трубках (в разрезе) 1?—?верхний электродный резервуар; 2 — центральный цилиндр; 3 — верхний платиновый электрод; 4 — резиновая прокладка; 5 — трубочка с гелем; 6 — нижний электродный резервуар; 7?— нижний платиновый электрод кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см. выше). Под действием собственного веса они могут постепенно сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают, главным образом, в случае препаративного электрофореза, когда соотношение поверхности и объема колонок геля способствует его сползанию.

Все приборы с вертикальным расположением гелей конструктивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, так как верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с трубками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые прокладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара. Схема такого прибора показана на рис. 5.

Трубки (12?—?18 штук) с уже заполимеризованным в них гелем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждающей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за продвижением фронта красителя в процессе электрофореза. В резервуарах должны быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать ся так, чтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протеканию через них тока. Объемы электродных резервуаров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изменялся под влиянием продуктов электролиза.

Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электрофорез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5?—?6 мм и длину около 10 см. Фирма «Bio-Rad» в своем приборе модели 155 предлагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до 14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в пламени горелки во избежание образования незаметного на глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после окончания электрофореза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок заклеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор мономеров сразу после добавления и надежного смешивания с ним раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний участок трубки, предназначенный для внесения препарата, оставался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза (см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабочего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают верхним электродным буфером.

Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает электродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5?—?10% сахарозы. Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхности геля; препарат должен выливаться с высоты 2?—?3 мм над гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей повышенной плотности. При любом варианте электрофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут собираться на торце геля и нарушать однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить центрифугированием.

Выше уже упоминалось о возможности использования градиента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведены соображения, касающиеся подбора концентраций инициирующих добавок в этом случае. Преимущества таких «градиентных» гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиентных гелей используют такие же смесительные устройства, как при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацентрифугирования. В этом случае также можно получать линейные и нелинейные градиенты, «выпуклые» и «вогнутые», в том числе экспоненциальные.

В смеситель можно поместить раствор мономеров с максимальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительного устройства — соответственно разбавленный раствор. Затем можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно центрифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду малого объема трубки (2?—?4 мл). Кроме того, почти всегда желательно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее резинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, чтобы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном, Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6) Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе градиентного устройства должен находиться раствор мономеров малой концентрации, а в резервуаре — концентрированный раствор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно увеличивалась одновременно с повышением содержания акриламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концентрированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше начинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, находящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.

Следует помнить о необходимости промывки смесительного устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после окончания их использования, до того как в них произойдет полимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подводящую к нему трубку.

По окончании полимеризации всю пачку трубок следует извлечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя технически и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lorentz, 1976].

В описанном приборе для вертикального электрофореза электрическая цепь надежно замыкается непосредственными контактами обоих концов трубок с электродными буферами. Однако надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения трубок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струёй жидкости, направленной из шприца с согнутой иглой.

По окончании электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с другого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленного несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5?—?1% какогонибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси геля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах диаметром 0,7?—?1,5 мм [Condeelis, 1977].

Вертикально расположенные пластины

Для электрофореза белков обычно используют пластины шириной 8?—?14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8?— 28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, например при секвенировании, нередко ведут в больших пластинах размером 33???43 см, что диктуется максимальным размером рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гидролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зеркального стекла толщиной 5?—?6 мм. Расстояние между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10?—?15 мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Для аналитических целей, как правило, используют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от 0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевшего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боковых прокладок.

Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидрофобности материала можно не смазывать. Прокладки из плексиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хорошо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые прокладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю прокладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу, следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в полость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по всему периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажимают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить проще — заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопластырем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания не произойдет. Для надежности можно сначала залить небольшой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а потом залить остальной ее объем.

Описано применение в качестве прокладки П-образной полоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка не нуждается в смазке [Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо нижней прокладки сделать в нижней части формы «пробку» из ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боковыми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавливают в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирующими добавками, так, чтобы заполнить нижнюю часть формы на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок. Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаивают воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают. Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над пробкой и промыть поверхность буфером геля. Фирма «Bio-Rad» предлагает для заливки пластин геля простое устройство, позволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой резины. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее уплотнение осуществляют просто пластилином.

Собранную и уплотненную одним из описанных способов форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризовать — в горизонтальном положении пластин. Это значительно упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее по торцам пластин водостойкой липкой лентой.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как было показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препараты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов», куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют «гребенку» из тефлона или плексигласа такой же или чуть меньшей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис. 7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой. На боковом сечении можно видеть, что верхняя часть гребенки немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно — до упора выступа о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показаны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю прокладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы выступают наружу. За эти концы нижнюю прокладку и вынимают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже показаны только три зажима (с правой стороны пластин).

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru