Остерман Л. А. - Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование

Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их приблизительную эквимолярность. Напомним, что при использовании кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем, нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Существенной роли это не играет, если только гель не обнаруживает склонности к растрескиванию при высушивании (для авторадиографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо снизить.

Состав буферов, используемых для электрофореза белков и нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации акриламида. Природа, концентрация и рН буфера определяются особенностями самого процесса электрофореза, которые будут рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает также присутствие мочевины (даже в высоких концентрациях), гуанидинхлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза даже способствует полимеризации и улучшает механические свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содержать посторонних примесей.

Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклянных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детергентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть ще-.. точкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погрузить пластины или трубки на 1?—?2 ч в хромпик. Иногда их моют горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.

ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концентрации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержания геля в устройствах с вертикальным расположением трубок или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает теплопередачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхнего электродного резервуара, может образоваться между боковыми торцами пластины геля и прокладками, определяющими его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с наполнителями, а также смазки, которыми нередко герметизируют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку (лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для достаточно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использовать без смазки.

Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится затруднительным. В этом случае можно силиконировать стекло или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к которому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пластиной плексигласа удобно проводить для последующего горизонтального электрофореза. После окончания полимеризации плексиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на охлаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для горизонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое, налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в камеру, заполненную азотом.

Особого внимания требует полимеризация «градиентных» гелей с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло выделение при полимеризации такого геля будет заметно больше в его нижней части, где содержание акриламида выше, а это может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению градиента. Во избежание такого явления вместе с концентрацией акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы, полимеризация начиналась с верхнего края пластины или трубки и постепенно распространялась вниз.

Выбор концентраций мономеров

Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С — процентное отношение массы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Величина Т практически варьирует в пределах 3?—?30%, а С, как правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акриламид/Бис в пределах от 99 : 1 по 19 : 1. Однако в некоторых особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» далее будет опущен.

Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на этот выбор накладывают ограничения механические и адсорбционные свойства геля. Например, гели с T???5 и С?=?1 оказываются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3?—?5), т. е. отношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы «замыкается». Мелкопористые гели (T около 20) при высоком содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, поэтому для них величина С не должна превышать 1?—?2.

На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величина Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом глубже.

Неправильно было бы считать ПААГ регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити (при C???2) в среднем равно 50?—?100 мономерных единиц. Такая система не может быть внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, повидимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энергия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное «трение» их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно.

Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля так как средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется, — именно этого и можно было ожидать. Однако далее картина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С?>?15 гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, расположенным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономерных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров.

Между прочим, такая же ситуация возникает и при затвердевании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями. Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание крупнопористости и прочности, характерное для этих гелей.

Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень высоким содержанием метиленбисакриламида (С?>?15) хрупки, легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются. Этих недостатков лишены гели, сшитые NN/-диaллилтapтapдиaмидом. Например, гель с T?=?5 и С?=?15, сшитый ДАТД, оказывается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано успешное использование для электрофореза белков еще сильнее сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е. отношение акриламид/ДАТД не превышало 4?:?1 [Spath, Koblet, 1979].

Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополимеров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидко сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной силы раствора (u0). Электрофоретическую подвижность определяют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч) при напряженности поля 1?В/см. Величина и0 зависит от соотношения суммарного электрического заряда макромолекулы (при данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в электрическом поле, пропорциональна заряду, а противодействующая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жидкость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следовательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки заметим, что электрофоретическая подвижность большинства кислых белков в свободной жидкости при рН?8,8 лежит в пределах 0,1?—?0,5 см/ч на 1?В/см. Прямой корреляции между массой молекулы и величиной и0, очевидно, быть не должно.

В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е. чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что имеет место соотношение: ln(и'/и0)?=?—?kRT. Величина коэффициента торможения kR (порядка 0,1—?0,4) зависит от среднего радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличиваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобулярных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина (M?=?12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M?=?151 000).

Для эффективного разделения белков при электрофорезе в ПААГ соотношение u'/u0 должно составлять 0,1?—?0,2. Отсюда следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность белков в ПААГ лежит в пределах 0,01—?0,1 см/ч на 1?В/см. При напряженности поля 10??—??20 В/см этому соответствуют скорости миграции белков в диапазоне 0,1?—?2 см/ч. Таким образом, при рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения от них. Например, если заранее известно, что разделяемые белки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2?—?3 раза.

Выбор значения Т зависит от природы различия электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить только за счет трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости, почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.

Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разделения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионогенных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизительно, известны молекулярные массы. Если они различаются незначительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на крупнопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.

Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного качественного рассмотрения — заключение об определенной свободе выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем «сшивки» (С в пределах 2?—?5). В любом случае выбор значений Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в которых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжительность электрофореза (электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия пока не рассматривается).

В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать следующую полученную на практике таблицу соответствия молекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций ПААГ (Т):

Приступая к электрофоретическому фракционированию биополимеров, необязательно в точности воспроизводить значения Т и С, приведенные в литературе для сходного типа экспериментов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно воспроизводить в собственной серии опытов для надежной идентификации и сопоставления положения соответствующих полос.

Агароза

Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агарозы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза — это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются ?-D-галактопираноза и 3,6ангидро-?-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 104?—?105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

При температурах 84?—?96° (а у специальных типов — уже при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10?—?15 сП, что примерно соответствует вязкости 50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36?—?42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50?—?55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы.

Температуры плавления и гелеобразования зависят от содержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3?—?4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, сущность которого сводится к следующему.

Отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фазе и под действием электрического поля мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, поступающие из анодного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратированных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней — растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Они «дрейфуют» вместе с жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под действием электрического поля.

В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделяют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд Рис. 4. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер фракционирования двунитевых ДНК одинакового размера [Johnson et al., 1980] 1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо шает разделение. Ввиду этого агарозу подвергают специальной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, содержат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости можно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50%-ным этанолом [Lonnerdal, Laas, 1976].

Насколько существенно эндосмос может влиять на результаты электрофореза, видно из данных Джонсона и др. [Johnson et al., 1980]. Авторы использовали три типа агарозы с различной способностью к эндосмосу (значения —mr составляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усилением эндосмоса не только происходило сильное замедление скорости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже) менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому, различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-разному.

Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результате чего полосы расплываются с образованием «хвостов».

Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции (—mr). Знак «минус» здесь только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые кислоты «сносит» в сторону, противоположную направлению их миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы ниже будет использована номенклатура фирмы «Miles». По данным каталогов, в частности по значениям —mr ее нетрудно сопоставить с обозначениями других фирм, тем более что большинство из них получает свои препараты от одного и того же производителя — фирмы «Marine Colloids Inc.».

Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) —mr= =?0,1?—?0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выраженный эндосмос (—mr?=?0,23?—?0,26). Агароза типа ME занимает промежуточное положение (—mr?=?0,15?—?0,2). Чем меньше в ага розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростатического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Агароза с повышенными температурами плавления и гелеобразования (тип НGТ) имеет —mr0,1; именно она чаще всего используется для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная технологическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволяет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженными температурами плавления и затвердевания — тип LGT («Sea plaque» по номенклатуре фирмы «Marine Colloids»). Такая агароза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается жидким при физиологической температуре (37°); кроме того, плавление геля можно осуществить при температуре более низкой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуноэлектрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к катоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению, была разработана специальная агароза типа НЕЕО с сильно выраженным эндосмосом (—mr?>?0,3). Этого удалось добиться не за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых попрежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорбция белков на агарозе этого типа почти не происходит.