Жданов В. М., Ершов Ф. И. - Укрощение строптивых: рассказы о вирусах и вирусологии

(включая размножение), то перенос их в новое место или под сильный промотор (стимулятор синтеза иРНК для синтеза соответствующих белков) резко нарушает жизнедеятельность клеток. При изучении онкогенеза оказалось, что онкогены кодируют синтез регуляторных белков — протеинкиназ, эпидермальные факторы роста, белки, связывающие ДНК и др. При этом вирусные и клеточные онкогены, происходящие от нормальных клеточных генов, претерпевают изменения вследствие мутаций.

Канцерогенез — многоступенчатый процесс, в котором участвуют несколько или по крайней мере два онкогена. Один из них вызывает беспредельное размножение клеток, делающих их культуру бессмертной (иммортали-зация). При вирусном канцерогенезе этот ген часто бывает вирусным. Другой (часто он бывает клеточным) вызывает злокачественное перерождение (трансформация) клеток.

Таким образом, вирусный канцерогенез является частным случаем общего (невирусного) канцерогенеза, связанного с деятельностью, а точнее с ошибками в функционировании блуждающих генов, или транспозо-нов. Естественно, что не эти ошибки, а нормальная деятельность является основой существования транспо-зонов, делающих геном клеток бактерий, растений и животных мобильным, быстро реагирующих на изменение условий внешней среды, а рак и лейкозы у животных являются своеобразной платой за ошибки, совершаемые в процессе функционирования транспозонов. Характерно, что вирусы, имитирующие деятельность транспозонов, сходны с ними и по строению соответствующих участков генетического аппарата, вплоть до наличия в них сильных промоторов.

Таким образом, изучение опухолеродных вирусов позволило понять многие стороны общего канцерогенеза, в котором вирусам отводится роль частных факторов общих патологических процессов, результатом которых является превращение нормальной клетки в раковую.

Механизмы взаимодействия вирусов с клетками

Взаимоотношения вирусов с клетками зависят от многих условий и определяются прежде всего свойствами вирусов и чувствительностью клеток. Например, к клеткам, не содержащим соответствующих рецепторов, вирус не может прикрепиться, а следовательно, проникнуть внутрь и начать разрушительное действие. Но и при наличии рецепторов клетки могут оказаться нечувствительными к вирусу, и инфекционный процесс в них не разовьется. Наконец, если клетки чувствительны к вирусу, это еще не означает, что он обязательно убьет их. В природе, пожалуй, нет вирусов, способных заражать и убивать все клетки. Обычно исход взаимодействия вирусов с клетками зависит от количества проникшего вируса (так называемая множественность заражения).

В организме действие вирусов вызывает активное противодействие, выражающееся в образовании интерферона и включении системы иммунитета. Вирусные белки, будучи чужеродными для организма, играют роль антигенов, вызывая в ответ образование антител. Основная их функция — находить и обезвреживать антигены. В этой работе антителам помогают многочисленные иммунные клетки, которые захватывают и переваривают вирусные частицы.

Организм не только не расправляется с проникшим в него вирусом, но и готовится к будущим встречам с ним. Давно замечено, что переболев человек редко вновь заболевает той же вирусной болезнью. Но, если это все же происходит, заболевание протекает гораздо легче.

Для защиты от вирусов человек совсем не обязательно должен встречаться с ними. Известно, например, что грудные дети редко болеют вирусными инфекциями. Природа позаботилась, чтобы ребенок получал иммунитет пассивно с кровью матери в период беременности и с молоком после родов. Материнское молоко надежно защищает кишечник ребенка, т. е. главные ворота инфекции. Кроме того, детей вакцинируют против основных вирусных болезней, о чем мы расскажем дальше.

Немаловажную роль в защите от вирусов играет воспалительная реакция, направленная на ограничение распространения вирусов и фиксацию их в воротах инфекции. При этом, помимо всем известных макрофагов, противовирусный эффект вызывают повышение температуры и увеличение кислотности среды. Так специфические (иммунитет) и неспецифические (интерферон, воспалительная реакция и др.) стражи неусыпно охраняют здоровье.

Если проанализировать все, что мы теперь знаем о вирусах, можно прийти к парадоксальным выводам.

С одной стороны, вирусы могут преодолеть все барьеры и вызвать заболевание; с другой — организм способен успешно бороться с ним. Эти два крайних варианта можно рассматривать как единоборство, в котором побеждает одна из сторон, но между ними располагается множество других исходов. Например, и, возможно, это самый распространенный вариант, враги длительно сосуществуют, не нанося друг другу видимых повреждений. Такое сосуществование может продолжаться месяцы, годы и даже десятилетия. Как это ни странно, оно взаимовыгодно. С точки зрения вируса, — он нашел себе хозяина, который его кормит; с точки зрения организма, — он не болеет и платит за это сравнительно невысокую дань. Тем не менее установившееся равновесие непрочно, оно существует до поры, до времени. Механизмы такого равновесия многообразны и до конца не изучены. В одних случаях большинство клеток организма может быть нечувствительно к вирусу, но небольшая часть клеток-мутантов все же позволяет ему незначительно размножаться и таким образом существовать. В других случаях мутантным (генетически измененным) является уже вирус. В процессе его размножения образуются неполноценные вирионы — частицы, в которых частично или полностью отсутствует генетический материал (РНК или ДНК). Такие вирионы определяются как дефектные. Это означает, что, будучи сами по себе неполноценными, они нарушают образование нормальных вирионов.

Далее следует упомянуть встречающиеся в природе температурочувствительные мутанты вирусов, способные размножаться лишь при определенных температурах. Поэтому повышение температуры, столь характерное для вирусных болезней, убивает эти вирусы, а нормализация температуры поддерживает размножение выживших вирионов до количества, вызывающего новое повышение температуры. Так устанавливается волнообразный процесс динамического равновесия в этом случае.

Однако вернемся к организму. Существует широкая индивидуальная вариабельность в способности организма продуцировать интерферон, антитела и другие защитные факторы. Мы не говорим здесь о врожденных дефектах иммунитета, а имеем в виду так называемую нормальную резистентность организма. Уровень ее может повышаться и снижаться в зависимости от многих условий (стрессы, питание, погода, возраст). Естественно, вирусы, периодически попадающие в организм, могут оказаться на благоприятной или неблагоприятной для них почве, и в первом случае вызвать болезнь, а во втором — погибнуть или затаиться. Размножение их в этом случае идет вяло и присутствие ничем не проявляется, хотя полного уничтожения тоже не происходит.

Для простоты изложения мы условно разделили возможные варианты сосуществования вирусов и клеток. На самом же деле в организме они могут сочетаться, что намного усложняет анализ латентных и хронических инфекций, которые, как теперь становится ясно, встречаются гораздо чаще, чем острые вирусные заболевания.

В заключение вспомним еще об одном механизме взаимодействия вирусов с клетками. Попавшим под иммунный пресс вирусам не остается ничего другого, как несколько видоизмениться и таким образом избежать нейтрализующего действия антител и других иммунных механизмов. Такой антигенный дрейф дает им возможность выжить. Это явление хорошо объясняется дарвиновскими законами о борьбе за существование и выживание наиболее приспособленных. Описанный вариант дрейфа мы проиллюстрируем позже на примере вируса гриппа.

Глава 7 От сложного к простому

(эволюция методов вирусологии)

Нет, мы не ошиблись в названии этой главы, так как методы вирусологии развивались именно так — от сложного к простому, а не наоборот. Сначала были разработаны методы исследования даже не вируса как такового, а вирусной инфекции, затем, когда научились выделять вирус в чистом виде, появилась возможность изучать не только вирусную инфекцию, но и сам вирус, и лишь значительно позже стало возможным изучение составных частей вируса — его нуклеиновой кислоты, белков, липидов, углеводов.

Лабораторные животные

А началось, как уже было сказано в первой главе, с того, что научились отличать вирусы от бактерий, а точнее — вирусные инфекции от бактериальных с помощью ультрафильтров Шамберлана и Беркефельда. Этот немудреный прием позволил Д. И. Ивановскому открыть мир вирусов, а сами вирусы многие годы обозначались как фильтрующиеся вирусы, или ультравирусы.

Вплоть до середины 30-х годов экспериментальные заражения животных или растений и ультрафильтрация являлись главными методами распознавания вирусов. Наиболее часто в качестве экспериментальных животных использовались белые мыши, белые крысы, морские свинки и кролики. Их и теперь можно встретить в вирусологических лабораториях, где они применяются с другой целью, чем на заре развития вирусологии.

К сожалению, жатва, собранная при использовании экспериментальных животных, была относительно невелика, так как они невосприимчивы к большинству вирусных инфекций человека. Когда речь шла о вирусах домашних животных, работа облегчалась: эти животные и становились экспериментальной моделью. Таким путем гениальный Л. Пастер выделил и ослабил, сделав возможным применение для прививок, вирус бешенства путем внутримозговых пассажей на кроликах еще до начала вирусологической эры. Второй из открытых вирусов — вирус ящура, поражавший крупный рогатый скот, был выделен путем заражения телят фильтратами пораженных тканей. Таким же путем были выделены от кур и пассированы на курах онкогенные вирусы (миелоб-ластоза и саркомы Рауса). К ним надо добавить вирусы чумы птиц, ложного бешенства, чумы собак и рогатого скота, бородавок разных видов животных, а также некоторые вирусы насекомых и несколько десятков вирусов растений.

К середине 30-х годов с помощью лабораторных животных были открыты возбудители гриппа и герпеса. К вирусу гриппа весьма чувствительными оказались хорьки. Использование обезьян в качестве лабораторных животных позволило открыть вирусы оспы, полиомиелита, желтой лихорадки, денге. В 40-е — 50-е годы была показана высокая чувствительность новорожденных животных — мышей, крыс и хомяков к разным вирусам, особенно к вирусам, передающимся членистоногими (арбо-вирусы). Именно путем естественного заражения (укусы насекомых в природных очагах арбовирусов) или при введении вируссодержащего материала в мозг было открыто подавляющее большинство известных в настоящее время арбовирусов. Открытие новых вирусов этими методами продолжается до сих пор.

В настоящее время стандартные лабораторные животные — мыши, крысы, морские свинки, кролики, нечувствительные к большинству вирусов человека и животных, нашли другое применение. Для идентификации любого вируса требуется сыворотка, содержащая антитела против него. Такую сыворотку можно получить путем иммунизации лабораторных животных препаратами вируса, желательно хорошо очищенного от примесей. Такая сыворотка нейтрализует только тот вирус, которым были иммунизированы лабораторные животные. В каждой вирусологической лаборатории имеется набор сывороток, специфически нейтрализующих разные вирусы. Без постановки реакций вируса с антителами (иммунологическая диагностика вирусов) были бы невозможными не только исследования, но и первичная идентификация вирусов.

Куриные эмбрионы

В середине 30-х годов австралийский вирусолог Ф. Вернет «открыл» новое для вирусологии экспериментальное животное — куриные эмбрионы. Для заражения вирусами обычно используют 10—12-дневные куриные зародыши, у которых в это время хорошо развиты оболочки — хорионаллантоисная и амниотиче-ская. При заражении их разными вирусами может развиться вирусная инфекция. При этом размножение вируса происходит в течение 3—4 дней, когда иммунитет еще не успевает развиться.

Использование куриных эмбрионов позволило выделить еще несколько вирусов человека — парагриппа, свинки, оспы, гриппа (последние два раньше были выделены от обезьян и хорьков). Однако главное достоинство куриных эмбрионов заключалось не в этом. При заражении экспериментальных животных, чувствительных к тому или иному вирусу, этот последний накапливается во внутренних органах или нервной ткани, откуда его трудно выделить в чистом виде, освободив от клеточных белков. Иное дело куриные эмбрионы: размножаясь в зародышевых оболочках, вирус выделяется в аллантоис-ную и амниотическую жидкость, где накапливается в громадных количествах (до нескольких миллиардов вирионов в 1 мл) В дальнейшем вирус может быть осажден в центрифуге и дополнительно очищен разными методами.

Применение куриных эмбрионов привело к подлинной революции в изучении вирусов, которая была продолжена и завершена введением в вирусологическую технику метода культур тканей. Особенно важное значение имела техника культивирования вирусов в куриных эмбрионах для изучения вируса гриппа. Было обнаружено, что вирусы гриппа склеивают (агглютинируют) эритроциты зародыша курицы. На основе этого феномена была разработана техника реакции агглютинации эритроцитов, которая и до сих пор широко применяется для диагностики гриппа и многих других вирусных инфекций. Выделение препаратов очищенного вируса гриппа дало возможность исследовать химический состав вируса гриппа и других вирусов, размножающихся в куриных зародышах, изучить динамику их размножения и др. Техника работы с вирусами на куриных эмбрионах сохранила свое значение и в настоящее время. Кроме куриных эмбрионов, в некоторых случаях используются эмбрионы других птиц — уток, перепелок.

Культуры тканей

Попытки выращивать клетки вне организма, притом успешные, предпринимались еще в прошлом столетии. Однако только в конце 40-х годов XX века в связи с развитием производства тонких химических реактивов стало возможным получение питательных сред для выращивания клеток вне организма в виде однослойной культуры тканей. Такие однослойные культуры клеток обезьян были получены американским ученым Д. Эндерсом и его сотрудниками, и на них был выращен вирус полиомиелита. Вскоре были получены культуры разных тканей человека и многих видов животных. За этим последовал настоящий взрыв открытий вирусов человека и животных. Примерно /3 ныне известных вирусов были открыты за два десятилетия, прошедшие после введения в вирусологию метода однослойных культур тканей.

При заражении животного патогенным для него вирусом развивается болезнь с характерными для нее симптомами. При заражении культуры клеток вирусом, к которому эта культура чувствительна, обычно наблюдаются так называемые цитопатические проявления, т. е.

изменения или повреждения клеток, характерные для того или иного вируса. Так, вирус полиомиелита вызывает гибель клеток и разрежение клеточного пласта, аденовирус вызывает округление клеток и постепенную их гибель, при заражении вирусом кори происходит слияние клеток и образование гигантских клеток (сим-пласты), содержащих несколько ядер, при заражении клеток вирусами оспы в них появляются своеобразные включения, в которых происходит размножение вируса. Цитопатическое действие проявляется различно у разных вирусов и на разных клетках.

При смешивании вируса с иммунной к нему сывороткой происходит нейтрализация вируса, и поэтому в клетках, зараженных такой смесью, цитсшатический эффект не проявляется. Это наблюдение легло в основу метода титрования вирусов по цитопатическому эффекту. Титрование — это прием количественного определения вируса, при котором разведениями вируса 1:10, 1:100, 1:1000 и т. д. заражают чувствительные к нему клетки. Максимальное разведение вируса, вызывающее цитопа-тический эффект у единичных клеток клеточного пласта (монослоя), принимают за инфекционную дозу вируса. Подобным образом определяют и активность иммунных сывороток, только в этом случае берут одну и ту же дозу вируса, которую смешивают с разными разведениями иммунной сыворотки.

При использовании культур тканей, так же как и на куриных эмбрионах, удается получить очищенный вирус, который выделяется из клеток в жидкую культуральную среду. Отсюда его можно выделить, осадив в центрифуге, а затем очистить, применяя для этой цели разные методы.

Различают первичные и перевиваемые культуры тканей. Первичные готовят из органов умерщвленного животного или трупа человека, взятых в течение ближайших часов после смерти, когда большинство клеток еще сохраняют свою жизнеспособность. Кусочки органов тщательно измельчают для удаления мертвых клеток. Клеточную взвесь переваривают раствором трипсина. Затем клетки отмывают, взвешивают в культуральной (питательной) среде и разливают в плоскодонные бутылки (матрацы) или чашки. Для соблюдения стерильности все процедуры проводят в специальных боксах и к культурам клетки добавляют антибиотики, препятствующие росту случайно попавших бактерий.

Если выросшие клетки перенести в новые матрацы и чашки, то может вырасти вторичная культура, а при многократных перевивках удается получить перевиваемые культуры тканей. В настоящее время имеются многие сотни разных перевиваемых культур тканей человека и животных, которые чувствительны к разным вирусам и широко применяются для проведения вирусологических исследований.

Мы уже говорили, что культуры тканей в вирусологии произвели подлинную революцию в этой науке, так как позволили перейти от изучения вирусной инфекции к изучению самого вируса — его строения, химического состава, способа репродукции (размножения); обеспечили возможность следующего этапа развития вирусологии — выхода ее на молекулярный и субмолекулярный уровни. Разновидностью культур клеток и тканей являются органные культуры — кусочки легких, трахеи, печени, почек и других органов, которые в процессе выращивания сохраняют свойственную данному органу структуру. Некоторые вирусы более успешно выращиваются в органных культурах, чем в культурах тканей.

Молекулярная вирусология

В 1962 г. вирусологи многих стран собрались на симпозиуме в США, чтобы подвести первые итоги развития молекулярной вирусологии. На этом симпозиуме звучали не совсем привычные для вирусологов термины: архитектура вирионов, нуклеокапсиды, капсомеры. Начался новый период в развитии вирусологии — период молекулярной вирусологии.

Молекулярная вирусология, или молекулярная биология вирусов, — составная часть общей молекулярной биологии и в то же время — раздел вирусологии. Это и неудивительно. Вирусы — наиболее простые формы жизни, и поэтому вполне естественно, что они стали и объектами изучения, и орудиями молекулярной биологии. На их примере можно изучать фундаментальные основы жизни и ее проявления.

С конца 50-х годов, когда начала формироваться синтетическая область знаний, лежащая на границе неживого и живого и занимающаяся изучением живого, методы молекулярной биологии хлынули обильным потоком в вирусологию. Эти методы, основанные на биофизике и биохимии живого, позволили в короткие сроки изучить строение, химический состав и репродукцию вирусов.

Поскольку вирусы относятся к сверхмалым объектам для ,их изучения нужны сверхчувствительные методы С помощью электронного микроскопа удалось увидеть отдельные вирусные частицы, но определить их химиче ский состав можно только, собрав воедино триллионь таких частиц. Для этого были разработаны методь ультрацентрифугирования. Современные ультрацентри фуги — это сложно устроенные приборы, главной частые которых являются роторы, вращающиеся со скоростью в десятки тысяч оборотов в секунду.

Здесь нет надобности рассказывать о других методах молекулярной вирусологии, тем более что они меняются и совершенствуются из года в год быстрыми темпами Если в 60-х годах основное внимание вирусологов было фиксировано на характеристике вирусных нуклеи новых кислот и белков, то к началу 80-х годов была расшифрована полная структура многих вирусных генов и геномов и установлена не только аминокислотная пос ледовательность, но и третичная пространственная струк тура таких сложных белков, как гликопротеид гемагглю тинина вируса гриппа. В настоящее время можно не только связать изменения антигенных детерминан' вируса гриппа с заменой в них аминокислот, но и рассчи тывать прошедшие, настоящие и будущие изменения этих антигенов.