Жданов В. М., Ершов Ф. И. - Укрощение строптивых: рассказы о вирусах и вирусологии

Опыт показал, что при хорошей организации и стыковке науки (приготовление вакцинальных вирусов), производства (массовое изготовление вакцины) и медицинской службы (организация и проведение прививок) можно достигнуть ощутимого эффекта в снижении заболеваемости гриппом. Конечно, такая работа требует больших затрат, использования большого количества ценного пищевого продукта (куриные яйца) и хорошей организации. При этом все усилия могут оказаться напрасными, если эпидемия будет вызвана новым шифтовым вариантом вируса гриппа.

Живые вакцины дают более длительный иммунитет, но применение их подчас связано с известным риском. Среди множества имеющихся в арсенале современной медицины вакцин лишь некоторые вводят в плановом порядке, другие же применяют по так называемым эпидемическим показаниям.

В настоящее время в плановом порядке вводят следующие вакцины. Новорожденный получает вакцину против туберкулеза (БЦЖ), затем детей вакцинируют против дефтерии, столбняка и коклюша, позже делают прививки против оспы, полиомиелита и кори. Таким образом, детей защищают против семи наиболее опасных вирусных и бактериальных инфекций. По эпидемическим показаниям вакцинируют население в природных очагах чумы, бруцеллеза, туляремии, японского и клещевого энцефалита.

Научно обоснованное использование вакцин позволило практически полностью освободить нашу страну от таких инфекций, как оспа, чума, холера, туляремия, которые были до революции важными причинами заболеваемости и смертности населения, особенно детей. Уровень заболеваемости при других вирусных и бактериальных инфекциях снижен благодаря вакцинации в десятки и сотни раз. Так, вацина против полиомиелита (готовится на культуре клеток почек обезьян) стала широко применяться весной 1954 г., когда распространение полиомиелита приняло угрожающие размеры. Уже через 3 года число случаев этого заболевания было резко уменьшено, а в настоящее время отмечаются лишь единичные случаи полиомиелита.

А теперь давайте посмотрим, как долго держится иммунитет после вакцинации против главных и наиболее тяжелых вирусных инфекций:

грипп 2 — 3 года оспа 3 — 5 лет полиомиелит более 5 лет краснуха 5 — 8 лет свинка 6 — 8 лет корь 8 — 15 лет желтая лихорадка более 17 лет бешенство пожизненный

Вот чего можно добиться применением современных противовирусных вакцин. Понятно, что вакцины относительно кратковременного действия нужно вводить повторно.

Метод вакцинации выдержал испытание временем. В основе его, как мы видим, лежит включение системы иммунитета, т.е. созданной самой природой системы защиты.

Вирусологическая реанимация

Близкое отношение к вакцинам имеют иммунные сыворотки (точнее, гамма-глобулин) — специально полученные препараты, содержащие антитела против вирусов. Они используются в тех случаях, когда болезнь развивается быстро и с вакцинацией уже не успеть.

В отличие от активного иммунитета, формирующегося в процессе заболевания, иммунитет, вызванный гамма-глобулинами, называется пассивным. В этом случае организм получает уже готовые антитела, а не вырабатывает их сам. Для развития такого иммунитета требуется всего несколько часов, хотя и держится он сравнительно недолго (до 1 мес). Поэтому сыворотки следует вводить возможно раньше от начала болезни (желательно сразу же после заражения). Подобные инъекции повторяют несколько раз. Болезнь при этом либо вообще не развивается, либо протекает в более легкой форме. Попав в организм, антитела обезвреживают, ограничивают или вообще останавливают распространение вирусов.

Обычно гамма-глобулины получают из крови людей, переболевших определенным заболеванием, или из крови животных (чаще лошадей), специально иммунизированных соответствующими вакцинами.

С профилактической целью гамма-глобулин вводят внутримышечно лицам, которые имели контакт с больными и могли заразиться. Для лечения гамма-глобулин рекомендуется вводить в первые 2 дня от начала заболевания.

Глава 11 От утопии- к науке

(первые успехи химиотерапии вирусных болезней, лекарства против гриппа и герпеса)

К сожалению, далеко не при всех вирусных болезнях массовая вакцинация служит надежным барьером. Высокая избирательность, или специфичность действия, вакцин оборачивается их недостатком. В случаях, когда однотипные заболевания, например острые респираторные, вызываются многими вирусами (напомним, что их более 150), вакцинация становится практически невозможной.

Даже лучшие образцы противогриппозных вакцин могут обеспечить лишь снижение уровня заболеваемости, но не ликвидацию гриппа вследствие большой изменчивости вирусов.

Даже если приготовить вакцины против всех болезнетворных вирусов (а их более 500), что теоретически возможно, то охватить прививками всех людей нереально. Так возникла потребность в разработке новых подходов к борьбе с вирусами — химиотерапии вирусных инфекций. В отличие от вакцинации ее конечной целью является не предупреждение, а лечение болезни.

Существенной задачей настоящих и будущих исследований является целенаправленный поиск путей активного вмешательства в размножение вирусов. Эта очень непростая задача, если вспомнить все, что мы говорили раньше об особенностях размножения вирусов, но именно она является конечной целью химиотерапии вирусных инфекций.

К сожалению, ни один из широко распространенных сульфаниламидных препаратов и антибиотиков не подавляет размножение вирусов. Дело в том, что вирусы, как вы уже знаете, размножаются внутри клеток, используя их системы, поэтому любое воздействие на синтез вирусов приводит к нарушению обмена веществ клеток и большинство препаратов, подавляющих размножение вирусов, угнетают жизнедеятельность клетки-хозяина. Испытание широко известных антибиотиков и антиметаболитов, обладающих выраженной способностью подавлять развитие вирусов в пробирке, показало их малую эффективность в организме в безвредных для него концентрациях. Отсюда возникло сомнение в возможности создания химических препаратов направленного противовирусного действия и одновременно безвредных для организма.

Все, что теперь известно о вирусах, позволяет разработать правильную стратегию поиска новых химиоте-рапевтических веществ. Конечно, самой простой точкой приложения таких препаратов могут быть вирусные белки, уязвимые для антител. Они точно и безошибочно находят вирусы в организме и надежно нейтрализуют их. Однако если вирус проник внутрь клетки, он становится недоступным для антител. Здесь нужно что-то иное. Давайте вспомним основные этапы размножения вирусов и посмотрим еще раз на рис. 6. Теоретически вирус можно остановить на стадии адсорбции (проникновения в клетку), синтеза компонентов (композиции) или выхода из клетки.

Идеальными химиотерапевтическими препаратами могут быть вещества, способные работать как стоп-сигнал, останавливающий размножение вирусов на той или иной стадии. Первые такие препараты уже используются для лечения гриппа. В нашей стране и США был получен сначала амантадин, а затем его производное — ремантадин, который, будучи столь же эффективным, как амантадин, лишен токсических свойств последнего. Ремантадин действует на ранней стадии репродукции вируса в клетке.

Напомним, что началу вирусиндуцированных синтезов предшествует проникновение вируса в клетку и два этапа его раздевания: разрушение внешних оболочек и обнажение сердцевины (нуклеотида) вирионов и затем — разрушение внутренней мембраны и освобождение нук-леокапсида, биохимически активного и способного начать вирус-индуцированные синтезы. Ремантадин предотвращает вторую стадию раздевания, вступая в связь с молекулами белка, и поэтому дальнейшее развитие вируса гриппа в клетке приостанавливается,

В клинических испытаниях ремантадин оказался весьма эффективным лечебным средством при применении его в 1-е сутки болезни. В этом случае течение болезни, как было сказано ранее, не только облегчается, но может быть полностью приостановлено. Если ремантадин применяется профилактически людям, окружающим больного, то число заболеваний среди них снижается в 4—5 раз. Ремантадин все чаще применяется не только для лечения, но и для профилактики гриппа. Этот препарат действует только на вирус гриппа А; он не действует на вирусы гриппа В, С и на многочисленных возбудителей острых респираторных заболеваний.

Препарат рибовирин имеет более широкий спектр действия, но эффективность его при гриппе значительно ниже, чем у ремантадина. Из других препаратов следует назвать теброфен, флореналь, а также индукторы интерферона, активные при лечение герпетических поражений глаз, кожи и половых органов.

Первые успехи химиотерапии указывают на перспективность этого способа борьбы с вирусами.

Глава 12 Дитя природы

(что мы теперь знаем об интерфероне — универсальном противовирусном препарате, созданном самой природой)

Полвека назад, еще на заре вирусологии был обнаружен странный феномен: при заражении животных вирусом одного типа они становились невосприимчивыми к другим вирусам. Феномен по аналогии с известным физическим явлением был назван интерференцией и изучен в меру технических возможностей того времени достаточно всесторонне. С практической точки зрения, наибольший интерес представлял вариант интерференции, при котором организм после введения безвредных вирусов становился нечувствительным к последующему заражению смертельно опасными возбудителями. Такой способ защиты от вирусов с помощью вирусов принципиально отличался от вакцинации, при которой включаются факторы специфического иммунитета.

Механизмы защитной реакции при интерференции оставались неясными. Лишь в 1957 г. английский ученый А. Айзеке и его сотрудник швейцарец Д. Линденманн доказали, что зараженные клетки вырабатывают особый белок, обладающий противовирусной активностью. Он был назван интерфероном и сразу же стал объектом пристального внимания многочисленных исследователей в разных лабораториях мира.

Интерес к интерферону с каждым годом нарастал. Причиной этого была его универсально широкая противовирусная активность. Кроме того, постепеннно были обнаружены многочисленные так называемые непротивовирусные эффекты интерферона. Сейчас уже ни у кого не вызывает сомнений, что этот белок относится к важнейшим факторам устойчивости организма и принимает самое непосредственное участие в иммунологических реакциях.

Способность клеток вырабатывать интерферон подчиняется строгим, еще не раскрытым до конца законам, но точно доказано, что эта способность является генетическим признаком, т. е. информация об интерфероне заложена в геноме клеток. Как оказалось, образование интерферонов является чуть ли не самой первой реакцией на сигнал тревоги, связанный с проникновением в организм вируса. Это как бы скорая помощь, посылаемая организмом к месту опасности, первый, часто непреодолимый для вирусов барьер. Создается впечатление, что даже сам исход заболевания (выздоровление или смерть) в значительной степени определяется способностью организма вырабатывать интерферон.

Накопленная за прошедшие 30 лет информация об интерфероне весьма обширна: десятки тысяч экспериментальных работ, около 100 обзоров и 20 монографий. Сейчас проблема интерферона вступила в пору зрелости. Здесь стоит кратко остановиться на хронологии, которая весьма поучительна, так как наглядно демонстрирует чрезвычайно быстрый прогресс знаний в современной биологии и медицине.

Первые 10 лет были посвящены исследованию общих закономерностей продукции и действия интерферона. В результате установлена универсальность этого феномена для всех позвоночных от рыб до человека включительно. В 1967 г. была доказана ведущая роль вирусных нуклеиновых кислот или их аналогов в стимуляции выработки интерферона и начат поиск наиболее активных индукторов, имеющих перспективу клинического использования. В последующие 5 лет (1967—1972) был обнаружен антиопухолевый эффект интерферона и его индукторов, а также было теоретически обосновано учение о системе интерферона и доказана ее важнейшая роль в сохранении постоянства внутренней среды организма. Эта система появилась 500 млн лет назад и стала важным эволюционным приобретением позвоночных. Выяснилось, что закономерности продукции и действия интерферона складываются из закономерно следующих друг за другом стадий и представляют собой своеобразную цепную реакцию.

В последние годы открыты основные компоненты системы интерферона. Удалось определить локализацию генов, ответственных за его образование и выделить информационные РНК, несущие программу о синтезе этого белка. При добавлении таких РНК к клеткам разных животных наблюдается образование функционально активного интерферона. Это было замечательным событием в биологии, и именно интерферон оказался первым полноценным клеточным белком, синтезированным вне организма. Важность этого достижения читатель поймет, дочитав эту главу до конца.

К настоящему времени налажено производство меди цинских препаратов интерферона из лейкоцитов донорской крови. Препараты используются для предупреждения и лечения вирусных инфекций и подавления роста злокачественных опухолей.

Итак, за четверть века интерферон проделал путь от неизвестности до всеобщего признания, и сейчас с ним связаны большие надежды. Оправдает ли он их — покажет будущее. Для получения всех этих данных потребовалось объединить усилия многих специалистов. Вирусологи выявили основные закономерности формирования и действия интерферона, биохимики разработали многоступенчатые методы его концентрации и очистки, химики синтезировали различные индукторы, цитогенети-ки определили локализацию в клетках генов интерферона, молекулярные биологи научились выделять эти гены, пересаживать их в другие клетки и заставлять работать в новых условиях, и наконец, врачи получили весьма многообещающие результаты целебного действия нового препарата.

Конечно, изучение интерферона проходило не гладко. За свою сравнительно короткую историю этот чудесный белок знал взлеты и падения, когда надежды и восхищение сменялись разочарованием, а за увлечением следовали периоды потери интереса. Надо отдать должное тем ученым, которые не переставали верить, что интерферон в конце концов займет достойное место среди противовирусных и противоопухолевых лекарственных средств.

Остановимся более детально на физико-химических свойствах, особенностях индукции, продукции и действия интерферона.

Одной из важнейших задач была и остается разработка методов получения высокоактивных препататов интерферона в необходимых количествах. Она оказалась чрезвычайно сложной и окончательно не решена до сих пор. Тем не менее именно благодаря этой работе удалось выявить многие особенности интерферонов. Оказалось, что это сравнительно небольшие полипептиды, обладающие необычной для белков устойчивостью в кислой среде, выдерживающие нагревание при 56—60°С в течение 1 ч. Самым замечательным свойством интерферонов следует считать их удивительно высокую активность, в сотни раз превышающую таковую известных ферментов и токсинов. Вместе с тем это свойство создает и большие трудности при попытках получить ощутимые количества интерферона. Дело в том, что из клеток-продуцентов можно получить не более 1 —10 тыс. ед. неочищенного интерферона на 1 мл питательной среды. Легко вычислить, что количество исходного материала для приготовления 1 мг чистого интерферона составит тысячи литров питательной среды. Однако самым сложным препятствием является то, что незначительное количество молекул интерферона связано с громадным количеством посторонних белков, избавиться от которых крайне сложно. В последние годы для решения этой задачи был использован принцип аффинной хроматографии. При этом молекулы интерферона извлекаются из исходной питательной среды с помощью антиинтерфероновых антител, прикрепленных к твердым гранулам и помещенных в специальные колонки. После того как все ненужные примеси проходят через такую колонку, чистый интерферон снимается с гранул специальными растворителями. Таким образом удается очистить интерферон приблизительно в 2 тыс. раз.

Вообще же для очистки и концентрации интерферона применяется довольно обширный арсенал современных методов белковой химии. Эти методы применяются в различных комбинациях, что позволяет получать препараты с высокой активностью. Недавно появились сообщения о получении идеально очищенных препаратов человеческого интерферона, так называемых гомогенных полипептидов, не содержащих посторонних примесей. Такие сверхчистые препараты пригодны для определения последовательности аминокислот, что в свою очередь является необходимым этапом последующего искусственного синтеза интерферона.

А теперь рассмотрим начальные этапы образования интерферонов. Индукторами их формирования служат многие природные и синтетические соединения. Прежде всего это вирусы и полученные синтетическим путем полимеры, имитирующие вирусные нуклеиновые кислоты. После обработки клеток индукторами наблюдается сравнительно недолгий период продукции интерферона, когда он освобождается в окружающую среду и затем может быть сконцентрирован и очищен.

Для удобства изложения систему интерферона условно делят на две части, одна из которых включает в себя процессы, связанные с продукцией интерферона, другая — процессы, связанные с его действием. Такое разделение условно, так как большинство клеток могут и синтезировать интерферон, и реагировать на его действие.

С помощью метода гибридизации соматических клеток удалось установить локализацию генов интерферона в хромосомах. Суть его сводится к слиянию клеток разных видов животных (например, человеческих и мышиных) в одно целое. Полученный гибрид имеет вначале полный набор хромосом человека и мыши, но по мере культивирования человеческие хромосомы постепенно утрачиваются. Параллельно утрачиваются некоторые признаки, характерные для клеток человека, в частности способность продуцировать интерферон человеческого типа. Используя этот метод, удалось доказать, что около 20 генов, ответственных за образование интерферона, локализуются скорее всего в 9-й хромосоме клеток человека, а за действие интерферона отвечает ген, локализующийся в 21-й хромосоме.

Открытие индукторов интерферона, генов, в которых он закодирован, и РНК, переносящих информацию о данном белке на рибосомы с последующим синтезом собственно интерферона, позволило расшифровать лишь первую часть системы интерферона (его продукцию). А можно ли каким-либо образом регулировать этот процесс? Естественно, нас прежде всего интересует возможность направленного увеличения продукции интерферона. Оказалось, что множество самых разнообразных физических, химических и биологических факторов способны подавлять или стимулировать образование интерферона. К ним относятся разные виды облучения, ионы кальция, инсулин, витамин С.

Более тонкое вмешательство в регуляцию продукции интерферона позволило разработать так называемый метод супериндукции, позволяющий получать в десятки и сотни раз больше этого ценного белка, чем при обычных способах индукции.

Теперь разберем действие интерферона. Сейчас доказана важнейшая роль интерферона в естественном выздоровлении человека и животных от вирусных инфекций. По сравнению с антителами — основными элементами противовирусного иммунитета интерферон обладает практически универсальной активностью против всех вирусов; он гораздо быстрее вырабатывается и подавляет размножение вирусов, уже проникших внутрь клеток, т. е. недоступных действию антител. Все сказанное позволило отнести систему интерферона к важнейшим факторам неспецифической резистентности. Он вырабатывается в первые часы после встречи организма с вирусом и представляет собой как бы первую линию защиты. Затем начинает работать система специфического иммунитета. Недавно было обнаружено, что интерфероны не проникают в клетки, а связываются со специфическими рецепторами на клеточной поверхности и посылают в ядро клетки особый сигнал об опасности.