Балаболкин М. И. - Эндокринология

4) гормоны, оказывающие свое действие путем стимулирования каскада киназ и фосфатаз.

Механизмы, участвующие в образовании вторичных мессенджеров, оперируют через активирование аденилатциклазы, гуанилатциклазы, фосфолипазы С, фосфолипазы А2, тирозинкиназ, Са2+- каналов и др.

Кортиколиберин, соматолиберин, ВИП, глюкагон, вазопрессин, ЛГ, ФСГ, ТТГ, хорионический гонадотропин, АКТГ, паратгормон, простагландины типа Е, D и I, b-адренергические катехоламины оказывают гормональное действие через активирование рецептора посредством стимуляции системы аденилатциклаза – цАМФ. В то же время другая группа гормонов, таких, как соматостатин, ангиотензин II, ацетилхолин (мускариновый эффект), дофамин, опиоиды и a2-адренергические катехоламины, угнетают систему аденилатциклаза – цАМФ.

В образовании вторичных мессенджеров для таких гормонов, как гонадолиберин, тиролиберин, дофамин, тромбоксаны А2, эндоперекиси, лейкотриены, агниотензин II, эндотелин, паратгормон, нейропептид Y, a1-адренергические катехоламины, ацетилхолин, брадикинин, вазопрессин, участвуют система фосфолипаза С, инозитол трифосфат, Са2+-зависимая протеинкиназа С. Инсулин, макрофагный колониестимулирующий фактор, тромбоцитарный производный фактор роста опосредуют свое действие через тирозинкиназу, а предсердный натрийуретический гормон, гистамин, ацетилхолин, брадикинин, эндотелийпроизводный фактор или оксид азота, который в свою очередь участвует в опосредовании вазодилататорного действия брадикинина, и ацетилхолин – через гуанилатциклазу. Следует отметить, что разделение гормонов по принципу активирующих систем или того или иного вторичного мессенджера условно, так как многие гормоны после взаимодействия с рецептором активируют одновременно несколько вторичных мессенджеров.

Большинство гормонов, взаимодействующих с плазматическими рецепторами, имеющих 7 трансмембранных фрагментов, активируют вторичные мессенджеры через связывание с гуанилатнуклеотидными белками или G-белками или регуляторными белками (Г-белки), которые являются гетеротримерными белками, состоящими из a-, b-, g-субъединиц. Идентифицировано более 16 генов, кодирующих a-субъединицу, несколько генов для b- и g-субъединиц. Различные виды a-субъединиц оказывают неидентичные эффекты. Так, a-s-субъединица ингибирует аденилатциклазу и Са2+-каналы, a-q-субъединица – фосфолипазу С, a-i-субъединица ингибирует аденилатциклазу и Са2+- каналы и стимулирует фосфолипазу С, К+-каналы и фосфодиэстеразу; b-субъединица стимулирует фосфолипазу С, аденилатциклазу и Са2+-каналы, а g-субъединица стимулирует К+-каналы, фосфодиэстеразу и угнетает аденилатциклазу. Точная функция других субъединиц регуляторных белков пока не установлена.

Гормоны, комплексирующие с рецептором, имеющим один трансмембранный фрагмент, активируют внутриклеточные ферменты (тирозинкиназу, гуанилатциклазу, серин-треонин киназу, тирозинфосфатазу). Гормоны, рецепторы которых имеют 4 трансмембранных фрагмента, осуществляют передачу гормонального сигнала через ионные каналы.

Исследованиями последних лет показано, что вторичные мессенджеры представляют собой не какое-то одно из перечисленных соединений, а многоступенчатую (каскадную) систему, конечным субстратом (веществом) которой могут быть одно или несколько биологически активных соединений. Так, гормоны, взаимодействующие с рецепторами, имеющими 7 трансмембранных фрагментов и активирующие Г-белок, затем стимулируют аденилатциклазу, фосфолипазу или оба фермента, что ведет к образованию нескольких вторичных мессенджеров: цАМФ, инозитол трифосфата и диацилглицерина. К настоящему времени эта группа представлена наибольшим количеством (более 100) рецепторов, к которым относятся пептидергические, дофаминергические, адренергические, холинергические, серотонинергические и другие рецепторы. В этих рецепторах 3 внеклеточных фрагмента (петли) ответственны за распознавание и связывание гормона, 3 внутриклеточных фрагмента (петли) связывают Г-белок. Трансмембранные (внутримембранные) домены гидрофобны, а вне- и внутриклеточные фрагменты (петли) – гидрофильны. С-терминальный цитоплазматический конец рецепторной полипептидной цепи содержит участки, где под влиянием активированных Г-белков происходит фосфорилирование, характеризующее активное состояние рецептора с одновременным образованием вторичных мессенджеров: цАМФ, инозитол трифосфата и диацилглицерина.

Взаимодействие гормона с рецептором, имеющим один трансмембранный фрагмент, приводит к активированию ферментов (тирозинкиназы, фосфаттирозинфосфатазы и др.), осуществляющих фосфорилирование тирозиновых остатков на белковых молекулах.

Комплексирование гормона с рецептором, относящимся к третьей группе и имеющим 4 трансмембранных фрагмента, приводит к активированию ионных каналов и вхождение ионов, что в свою очередь или стимулирует (активирует) серин-треониновые киназы, опосредующие фосфорилирование определенных участков белка, или приводит к деполяризации мембраны. Передача сигнала любым из перечисленных механизмов сопровождается эффектами, характерными для действия отдельных гормонов.

История изучения вторичных мессенджеров начинается с исследований Сатерленда и др. (1959), которые показали, что распад гликогена печени под влиянием глюкагона и адреналина происходит посредством стимулирующего влияния этих гормонов на активность фермента клеточной мембраны аденилатциклазы, которая катализирует превращение внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) в цАМФ (схема 1).

Схема 1. Конверсия АТФ в цАМФ.

Собственно аденилатциклаза является гликопротеином с молекулярной массой около 150 000 кДа. Аденилатциклаза участвует с ионами Mg2+ в образовании цАМФ, концентрация которого в клетке составляет около 0,01-1 мкг•моль/л, тогда как содержание АТФ в клетке достигает уровня до 1 мкг•моль/л.

Образование цАМФ происходит с помощью аденилатциклазной системы, которая является одним из компонентов рецептора. Взаимодействие гормона с рецептором первой группы (рецепторы, имеющие 7 трансмембранных фрагментов) включает, по крайней мере, 3 следующих друг за другом этапа: 1) активирование рецептора, 2) передача гормонального сигнала и 3) клеточное действие.

Первый этап, или уровень, представляет собой взаимодействие гормона (лиганда) с рецептором, что осуществляется посредством ионных и водородных связей и гидрофобных соединений с вовлечением не менее 3 мембранных молекул Г-белка или регуляторного белка, состоящего из a-, b- и g-субъединиц. Это в свою очередь активирует мембраносвязанные ферменты (фосфолипазу С, аденилатциклазу) с последующим образованием 3 вторичных мессендежров: инозитол трифосфата, диацилглицерина и цАМФ.

Аденилатциклазная система рецептора состоит из 3 компонентов: собственно рецептора (стимуляторная и ингибиторная его части), регуляторного белка с его a-, b- и g-субъединицами и каталитической субъединицы (собственно аденилатциклазы), которые в обычном (т.е. нестимулированном) состоянии разобщены между собой (схема 2). Рецептор (обе его части – стимулирующая и ингибирующая) располагается на внешней, а регуляторная единица – на внутренней поверхности плазматической мембраны. Регуляторная единица, или Г-белок, в отсутствие гормона связана гуанозиндифосфатом (ГДФ). Комплексирование гормона с рецептором вызывает диссоциацию комплекса Г-белок – ГДФ и взаимодействие Г-белка, а именно его a-субъединицы с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) и одновременное образование комплекса b/g-субъединицы, который способен вызывать определенные биологические эффекты. Комплекс ГТФ-a-субъединица, как уже отмечалось, активирует аденилатциклазу и последующее образование цАМФ. Последний активирует уже протеинкиназу А с соответствующим фосфорилированием различных белков, что проявляется также определенным биологическим действием. Кроме того, активированный комплекс ГТФ-a-субъединица в некоторых случаях регулирует стимуляцию фосфолипазы С, цГМФ, фосфодиэстеразы, Са2+- и К+-каналов и оказывает угнетающее влияние на Са2+-каналы и аденилатциклазу.

Схема 2. Механизм действия белковых гормонов путем активации цАМФ (объяснения в тексте).

Рс – рецептор, связывающий стимулирующий гормон,

Ст – стимулирующий гормон,

Ру – рецептор, связывающий угнетающий гормон,

Уг – угнетающий гормон,

Ац – аденилатциклаза,

Gy – гормонугнетающий белок,

Gc – гормонстимулирующий белок.

Роль гормона, таким образом, заключается в осуществлении замены комплекса Г-белок – ГДФ на комплекс Г-белок – ГТФ. Последний активирует каталитическую субъединицу, конвертируя ее в состояние, обладающее высокой аффинностью к комплексу АТФ-Mg2+, который быстро превращается в цАМФ. Одновременно с активацией аденилатциклазы и образованием цАМФ комплекс Г-белок – ГТФ вызывает диссоциацию гормонорецепторного комплекса путем снижения сродства рецептора к гормону.

Образовавшийся цАМФ активизирует в свою очередь цАМФ-зависимые протеинкиназы. Они представляют собой ферменты, осуществляющие фосфорилирование соответствующих белков, т.е. перенос фосфатной группы от АТФ к гидроксильной группе серина, треонина или тирозина, входящих в молекулу белка. Фосфорилированные таким образом белки непосредственно осуществляют биологический эффект гормона.

В настоящее время установлено, что регуляторные белки представлены более чем 50 различными белками, способными комплексироваться с ГТФ, которые подразделяются на Г-белки с небольшой молекулярной массой (20-25 кДа) и высокомолекулярные Г-белки, состоящие из 3 субъединиц (a – с мол. массой 39-46 кДа; b – 37 кДа и g-субъединица – 8 кДа). a-Субъединица является по сути ГТФазой, которая гидролизует ГТФ в ГДФ и свободный неорганический фосфат. b- и g-Субъединицы участвуют в образовании активного комплекса после взаимодействия лиганды с соответствующим рецептором. Высвобождая ГДФ в местах его связывания, a-субъединица вызывает диссоциацию и деактивацию активного комплекса, так как повторная ассоциация a-субъединицы – ГДФ с b- и g-субъединицами возвращает аденилатциклазную систему в исходное состояние. Установлено, что a-субъединица Г-белка в различных тканях представлена 8, b – 4 и g – 6 формами. Диссоциация субъединиц Г-белка в мембране клеток может приводить к одновременному образованию и взаимодействию различных сигналов, которые имеют на конце системы неодинаковые по силе и качеству биологические эффекты.

Собственно аденилатциклаза представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 115 – 150 кДа. В различных тканях идентифицировано 6 ее изоформ, которые взаимодействуют с a-, b- и g-субъединицами, а также с Са2+ кальмодулином. В некоторых видах рецепторов помимо регуляторного стимулирующего (Гс) и регуляторного ингибирующего (Ги) белка идентифицирован дополнительный белок – трансдуцин.

Роль регуляторных белков в передаче гормонального сигнала велика, структуру этих белков сравнивают с “кассетой”, и многообразие ответа связано с высокой мобильностью регуляторного белка. Так, некоторые гормоны могут одновременно активировать в различной степени как Гс, так и Ги. Более того, взаимодействие некоторых гормонов с рецепторными регуляторными белками вызывает экспрессию соответствующих белков, регулирующих уровень и степень гормонального ответа. Активация, как показано выше, регуляторных белков является следствием их диссоциации от гормонально-рецепторного комплекса. В некоторых рецепторных системах в это взаимодействие вовлечено до 20 и более регуляторных белков, которые помимо стимуляции образования цАМФ активируют одновременно и кальциевые каналы.

Определенное количество рецепторов, которые относятся к первой группе, имеющих 7 трансмембранных фрагментов, опосредуют свое действие вторичными мессенджерами, относящимися к производным фосфатидилинозитола: инозитолтрифосфат и диацилглицерин. Инозитолтрифосфат контролирует клеточные процессы за счет генерации внутриклеточного кальция. Эта мессенджерная система может активироваться двумя путями, а именно через регуляторный белок или фосфотирозиновые белки. И в том, и в другом случае далее происходит активирование фосфолипазы С, которая гидролизует полифосфоинозидную систему. Эта система, как указано выше, включает два внутриклеточных вторичных мессенджера, которые образуются из мембранного полифосфоинозида, называемого фосфатидилинозитол-4, 5-бифосфатом (ФИФ2). Комплексирование гормона с рецептором вызывает гидролиз ФИФ2 фосфорилазой, в результате чего и образуются указанные мессенджеры – инозитол трифосфат (ИФ3) и диацилглицерин. ИФ3 способствует повышению уровня внутриклеточного кальция в первую очередь за счет мобилизации последнего из эндоплазматической сети, где он локализутся в так называемых кальциосомах, а затем за счет поступления в клетку внеклеточного кальция. Диацилглицерин в свою очередь активизирует специфические протеинкиназы и, в частности, протеинкиназу С. Последние фосфорилируют определенные ферменты, ответственные за конечный биологический эффект. Не исключено, что разрушение ФИФ2 наряду с выходом двух мессенджеров и увеличением содержания внутриклеточного кальция индуцирует и образование простагландинов, являющихся потенциальными стимуляторами цАМФ.

Посредством этой системы опосредуется действие таких гормонов, как гистамин, серотонин, простагландины, вазопрессин, холецистокинин, соматолиберин, тиролиберин, окситоцин, паратгормон, нейропептид Y, вещество Р, ангиотензин II, катехоламины, осуществляющие действие через a1-адренорецепторы, и др.

В группу фермента фосфолипазы С входят до 16 изоформ, которые в свою очередь подразделяются на b-, g- и d-фосфолипазу С. Показано, что b-фосфолипаза С взаимодействует с регуляторными белками, а g-фосфолипаза С – с тирозинкиназами.

Инозитолтрифосфат осуществляет действие через собственные специфические тетрамерные рецепторы, имеющие молекулярную массу 4х313 кДа. После комплексирования с таким рецептором выявлены так называемые “большие” инозитолтрифосфатные рецепторы или рианодиновые рецепторы, которые также относятся к тетрамерам и имеют молекулярную массу 4х565 кДа. Не исключено, что внутриклеточные кальциевые каналы рианодиновых рецепторов регулируются новым вторичным мессенджером – цАДФ-рибозой (L. Meszaros и соавт., 1993). Образование этого мессенджера опосредуется цГМФ и оксидом азота (NO), который активирует цитоплазматическую гуанилатциклазу. Таким образом, оксид азота может представлять собой один из элементов передачи гормонального действия с участием ионов кальция.

Как известно, кальций находится внутри клетки в связанном с белками состоянии и в свободной форме во внеклеточной жидкости. Идентифицированы такие внутриклеточные белки, связывающие кальций, как кальретикулин и кальсеквестрин. Внутриклеточный свободный кальций, который выполняет роль вторичного мессенджера, поступает из внеклеточной жидкости через кальциевые каналы плазматической мембраны клетки или высвобождается внутриклеточно из связи с белками. Внутриклеточный свободный кальций влияет на соответствующие киназы фосфорилаз лишь будучи связанным с внутриклеточным белком-кальмодулином (схема 3).

Схема 3. Механизм действия белковых гормонов через СА2+ (объяснения в тексте) Р – рецептор; Г – гормон; Са+белок – внутриклеточный кальций в связанной с белками форме.

Кальмодулин – рецепторный белок с высокой аффинностью к кальцию – состоит из 148 аминокислотных остатков и присутствует во всех содержащих ядро клетках. Его молекулярная масса (мол.м.) – 17000 кДа, каждая молекула имеет 4 рецептора для связывания кальция.

В состоянии функционального покоя концентрация свободного кальция во внеклеточной жидкости выше, чем внутри клетки, благодаря функционированию кальциевого насоса (АТФазы) и транспортировке кальция из клетки в межклеточную жидкость. В этот период кальмодулин находится в неактивной форме. Комплексирование гормона с рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня свободного кальция, который вступает в связь с кальмодулином, превращает его в активную форму и оказывает влияние на кальцийчувствительные белки или ферменты, ответственные за соответствующий биологический эффект гормона.

Повышенный уровень внутриклеточного кальция стимулирует затем кальциевый насос, который “перекачивает” свободный кальций в межклеточную жидкость, снижает его уровень в клетке, вследствие чего кальмодулин переходит в неактивную форму и в клетке восстанавливается состояние функционального покоя. Кальмодулин также воздействует на аденилатциклазу, гуанилатциклазу, фосфодиэстеразу, фосфорилазкиназу, миозинкиназу, фосфолипазу А2, Са2+- и Mg2+-АТФазу, стимулирует высвобождение нейротрансмиттеров, фосфорилирование белков мембран. Изменяя транспорт кальция, уровень и активность циклических нуклеотидов и опосредованно обмен гликогена, кальмодулин участвует в секреторных и других функциональных процессах, протекающих в клетке. Он является динамическим компонентом митотического аппарата, регулирует полимеризацию микротубулярно-ворсинчатой системы, синтез актомиозина и активацию мембран кальциевого “насоса”. Кальмодулин – аналог мышечного белка тропонина С, который путем связывания кальция образует комплекс актина и миозина, а также активирует миозин-АТФазу, необходимую для повторного взаимодействия актина и миозина.

Са2+-кальмодулиновый комплекс активирует Са2+-кальмодулинзависимую протеинкиназу, которая выполняет важную роль в передаче нервного сигнала (синтез и высвобождение нейротрансмиттеров), в стимуляции или угнетении фосфолипазы А2, активирует специфическую серин-треонинпротеиновую фосфатазу, называемую кальцинеурином, которая опосредует действие Т-клеточного рецептора в Т-лимфоцитах.

Кальмодулинзависимые протеинкиназы подразделяют на две группы: многофункциональные, которые хорошо охарактеризованы, и специфические, или “специального назначения”. К первой группе относятся такие, как протеинкиназа А, опосредующая фосфорилирование многих внутриклеточных белков. Протеинкиназы “специального назначения” фосфорилируют некоторые субстраты, такие, как киназа легкой цепи миозина, фосфорилазкиназа и др.

Протеинкиназа С представлена несколькими изоформами (мол.м. от 67 до 83 кДа), которые кодируются 10 различными генами. Классическая протеинкиназа С включает 4 различных изоформы (a-, b1-, b2- и g-изоформы); 4 других белковых изоформы (дельта,- эпсилон,- пи и oмега) и 2 атипичных белковых формы.

Классические протеинкиназы активируются кальцием и диацилглицерином, новые белковые протеинкиназы – диацилглицерином и форболовыми эфирами, а одна из атипичных протеинкиназ не отвечает ни на один из перечисленных активаторов, но для ее активности требуется наличие фосфатидилсерина.

Выше отмечалось, что гормоны, рецепторы которых имеют 7 трансмембранных фрагментов, после образования гормоно-рецепторного комплекса связываются с G-белками, имеющими небольшой молекулярный вес (20-25 кДа) и выполняющими различную функцию. Белки, взаимодействующие с рецепторной тирозинкиназой, называются ras-белками, а белки, участвующие в транспорте пузырька – rab-белками. Активированная форма представляет собой G-белок, комплексированный с ГТФ; неактивная форма ras-белка является следствием его комплексирования с ГДФ. В активировании ras-белка участвует гуаниннуклеотидный высвобождающий белок, а процесс инактивации осуществляется гидролизом ГТФ под влиянием ГТФазы. Активирование ras-белка в свою очередь посредством фосфолипазы С стимулирует образование вторичных мессенджеров: инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Ras-белки впервые были описаны как онкогены (A.G. Gilman, 1987), так как повышенная экспрессия, или мутация, этих белков выявлена при злокачественных новообразованиях. В норме ras-белки вовлечены в различные регуляторные процессы, включая рост.

Некоторые белковые гормоны (инсулин, ИФР I и др.) свое первоначальное действие по активированию рецептора осуществляют через гормонально-чувствительную тирозинкиназу. Связывание гормона с рецептором ведет к конформационным изменениям или димеризации, которые вызывают активирование тирозинкиназы и последующее аутофосфорилирование рецептора. После гормональнорецепторного взаимодействия аутофосфорилирование усиливает как активность тирозинкиназы в другом димере, так и фосфорилирование внутриклеточных субстратов. Рецепторная тирозинкиназа является аллостерическим ферментом, в котором внеклеточный домен является регуляторной субъединицей, а внутриклеточный (цитоплазматический) домен – каталитической субъединицей. Активирование или фосфорилирование тирозинкиназы осуществляется через связывание с адапторным или SH2 белком, состоящим из двух SH2 доменов и одного SH3 домена. SH2 домены связывают специфические фосфотирозины рецепторной тирозиновой киназы, а SH3 связывают ферменты или сигнальные молекулы. Фосфорилированные белки (фосфотирозины) укорачиваются на 4 аминокислоты, что и обусловливает их специфическое высокоаффинное связывание с SH2 доменами.