Гуттман Б., Гриффите Э. и др. - Генетика

Когда на руках у врача пациент с безнадежно прогрессирующим заболеванием и когда известно, что ни диетические, ни какие другие меры не помогут, и когда имеется средство, предположительно способное остановить развитие заболевания, причем при помощи агента, подробно исследуемого на протяжении 40 лет, то почти не остается другого выхода, как попробовать им воспользоваться4.

Однако биологи редко вспоминают о том, что любой метод, способный исправить дефекты человеческой природы, почти с тем же успехом может быть использован и для того, чтобы намеренно вызвать такие дефекты у нормальных людей.

В 1971 году Карл Меррилл и его сотрудники заявили, что возможно лечить заболевания искусственно разводимых человеческих клеток при помощи трансдуцирующего фага лямбда. Они брали клетки кожи у пациентов, страдающих галактосемией, аутосомным рецессивным заболеванием, характеризующимся неспособностью превращать галактозу в глюкозу (сахар, из которого наш организм черпает энергию). Клетки этих людей не выполняют функцию, присущую одному из генов gal бактерии Е. coli. Заразив дефектные человеческие клетки штаммом, лямбда с бактериальными генами gal+, Меррилл и его коллеги получили клетки, в которых уровень необходимого фермента был даже выше обычного. Сами по себе эти эксперименты еще не являются окончательным доказательством трансдукции генов, как и эксперименты Роджерса. Тем не менее, опыты Меррилла позволяют предположить, что фаг лямбда может встраивать бактериальные гены в клетки человека и вызывать заметный эффект. Как мы увидим в дальнейшем, сейчас разработаны еще более изощренные способы переноса генов из одного организма в другой. Таким образом, в этой главе мы увидели, как такая, казалось бы, узко специфическая отрасль биологии, как бактериальная генетика, может повлиять на развитие научной мысли и иметь далеко идущие последствия для общества. Например, бактериальные плазмиды и вирусы можно использовать в качестве векторов, которые переносят фрагменты ДНК. Эксперименты с плазмидами и вирусами показали, что они могут реплицировать гены, перемещать их из одной клетки в другую и вставлять дополнительные фрагменты в геном клетки-хозяина. Эти ключевые явления послужили отправной точкой дош развития техники клонирования ДНК и генетической инженерии, о которых говорится в гл. 12.

Глава одиннадцатая. Регуляция генов и развитие организма

По мере чтения книги, как и на протяжении всей истории генетики, наше представление о генах постоянно изменялось. Если сначала мы считали ген неопределенным фактором, который каким-то образом передается по наследству, то теперь мы называем геном специфическую последовательность ДНК (иногда РНК), которая определяет структуру белка. Всякий ген располагается в хромосоме; все гены в своей совокупности составляют геном, определяющий жизнедеятельность организма. Но в этой картине ясно еще не все. Вы можете сказать: «Ну хорошо, я понимаю, как устроены гены и как они передают инструкции по синтезу самых различных ферментов и белков. Но посмотрите на меня! Я же не просто мешок с ферментами и даже не множество маленьких мешочков с ферментами, присоединенных к костям. Если мой геном и вправду определяет мою жизнедеятельность на протяжении всех этих лет, то они должны были как-то сделать так, чтобы я рос и из единственной клетки-зиготы превратился в высокоорганизованную структуру из многих видов клеток. Я хочу узнать, как мои гены определили мой рост и мое развитие». Если вам в голову приходили подобные мысли, то вы вступили на тот же путь, что и многие современные генетики, посвятившие свою профессиональную жизнь поиску ответов на вопросы о механизме развития организмов.

Здесь важно обратить внимание на то, что из одной клетки развиваются различные виды клеток. Во многих книгах по биологии и анатомии описаны различные типы тканей, из которых состоит тело человека, животных и растений. Все эти ткани, в свою очередь, состоят из клеток разных типов. Большинство наших клеток представляют собой подобие кубиков или цилиндров, которые образуют большие органы вроде печени, трубы вроде пищевода и кровяных сосудов, а также нижнюю часть кожного покрова. Плоские клетки создают гладкие поверхности внутри сосудов или внешние оболочки. Клетки мышц представляют собой либо очень длинные цилиндры, либо небольшие веретена с упорядоченными белковыми волокнами, которые вытягиваются и сокращаются. Наша нервная система содержит клетки с длинными и тонкими отростками (некоторые даже более метра в длину), которые очень быстро передают сигналы по всему телу. Всего в нашем организме более сотни различных видов клеток, и чем больше мы их исследуем, тем больше узнаем об их специализации.

Таким образом, можно перефразировать наш вопрос: «Как все эти клетки стали отличаться друг от друга?» Мы уже знаем достаточно, чтобы сказать, что они отличаются прежде всего тем, что производят разные виды белков. Если клетка вырабатывает белок, кодируемый определенным геном, то говорят, что этот ген выражен или что происходит его экспрессия. Таким образом, более правильным будет вопрос: «Как получается, что гены оказываются выраженными в строго определенном времени и месте? Какие механизмы регулируют процесс экспрессии генов?» Об этом мы и поговорим в данной главе.

Регуляция генов у бактерий

Как и в предыдущих главах, начнем с простых биологических систем, то есть с бактерий, при изучении которых этот вопрос впервые был поставлен. Исследования велись преимущественно в 1950-х и 1960-х годах, в основном в парижском Институте Пастера; эксперименты проводили французские ученые Франсуа Жако, Жак Моно и некоторые американские специалисты, приехавшие в Париж для совместной работы. Первые опыты касались одной интересной особенности Е. coli, обитающей в кишечнике млекопитающих. Известно, что млекопитающие, особенно на первых порах жизни, потребляют много молока, а основной сахар молока — лактоза. Следовательно, в процессе долгой эволюции бактерии приспособились жить в среде с лактозой, и у бактерий Е. coli имеются ферменты для ее переработки. Но поскольку уровень лактозы в среде не всегда одинаков, то у бактерий должен существовать какой-то механизм для определения присутствия лактозы. Е. coli — хорошо адаптированный организм, и метаболизм лактозы в нем прекрасно отрегулирован. Лактоза представляет собой двойную молекулу сахара (дисахарид), состоящую из простых Сахаров — галактозы и глюкозы. На первой стадии метаболизма фермент в-галактозидаза расщепляет дисахарид на составные части, которые клетка может перерабатывать на последующих стадиях. Если выращивать Е. coli в среде без лактозы, то бактерии произведут небольшое количество в-галактозидазы. Если же добавить в культуру лактозу, то через 3—5 минут в клетках можно наблюдать существенные изменения: они начинают вырабатывать фермент в 1000 раз быстрее прежнего, и только один этот фермент может составить несколько процентов от общей массы бактерии. Стоит удалить лактозу (при помощи фильтров или центрифугирования), как тут же в течение нескольких минут производство ферментов снижается до первоначального уровня.

Для исследования этого механизма Моно с коллегами использовали ставший классическим метод мутационного анализа. Они отбирали мутантов, не способных перерабатывать лактозу, и обнаружили несколько мутантов с дефектной в-галактозидазой, которых назвали мутантами lacZ. Выяснилось, что эти мутанты производят нормальный фермент, но, тем не менее, не могут расти в среде с лактозой. У них оказался дефектный белок галактозидпер-меаза, который доставляет галактозу через клеточную мембрану внутрь клетки. Мутанты с дефектной галактозидпермеазой получили название lacY. Картирование показало, что гены lacZ и lacY, названные так по мутантам, располагаются рядом друг с другом.

У наиболее интересных мутантов наблюдался дефект в регуляторной системе, поэтому они не могли начинать или останавливать экспрессию генов lac. Мутанты, названные lacI, одновременно вырабатывали в-галактозидазу и пермеазу и не имели средств их контроля. Примечательно, что ген lacI расположен рядом с генами Z и Y.

Последующие эксперименты позволили выяснить механизм контроля. Прежде всего, следует уяснить, что экспрессия гена подразумевает его транскрипцию — синтез матричной РНК. Вспомним, что транскрипцию осуществляет большой фермент РНК-полимераза, которая начинает транскрипцию с определенного места, примыкающего к кодирующему региону и называемого промотором. Для генов lacZ и lacY промотором служит небольшой участок между I и Z. Полимераза движется и производит РНК-транскрипт в определенном направлении: часто говорят, что чтение гена происходит сверху вниз. В таком случае промотор расположен выше гена lacZ. Ген lacI, который теперь называют геном-регулятором, кодирует белок lac-penpeccop. Это аллостеричес-кий белок (см. с. 281), который имеет два центра связывания и поэтому может присоединяться к двум разным молекулам. Один центр специфичен для небольшой последовательности ДНК, называемой оператором, которая располагается между промотором и геном lacZ. В отсутствие лактозы репрессор связывается с оператором, блокируя транскрипцию, поэтому гены Z и Yоказываются невыраженными.

Кроме того, у белка-репрессора имеется центр связывания с лактозой, поэтому если в среде есть лактоза, она связывается с репрессором, вследствие чего репрессор слегка изменяет свою форму и уже не может связываться с оператором. Поэтому репрессор отсоединяется от оператора, позволяя осуществлять транскрипцию генов Z и Y.

Таким образом, гены Z и У выражаются совместно. Такие гены, контролируемые одним оператором, называются опероном.

Геном бактерий насчитывает многие виды оперонов, которые регулируются по-разному. Например, регуляция генов биосинтеза, кодирующих ферменты для производства таких клеточных компонентов, как аминокислоты, происходит по иной схеме, противоположной описанной. Предположим, что клетка находится в среде, богатой всеми необходимыми аминокислотами. Если регуляция генов клетки происходит правильно, то она должна прекратить тратить лишнюю энергию на производство избыточных материалов. Гены биосинтеза ферментов также образуют опероны, но их регулируют другие виды бел-ков-репрессоров, которые связываются с оператором (и тем самым блокируют транскрипцию генов) только при наличии избытка аминокислот. Например, синтез гистидина кодируется большим блоком генов, который регулируется одним оператором и репрессором. Этот репрессор связывается с оператором и предотвращает транскрипцию генов только в том случае, когда в клетке имеется избыток гистидина. Если концентрация гистидина уменьшается, молекулы гистидина отсоединяются от молекул репрессора. Репрессор больше не может связываться с оператором, поэтому с оперона снова можно осуществлять транскрипцию.

Регуляция генов эукариот

Вопрос о регуляции генов в клетках эукариот требует иной постановки, поскольку образ жизни типичных эукариот коренным образом отличается от образа жизни прокариот. Прокариоты — это протые бактерии, живущие в окружающей среде, которая может постоянно изменяться. Их комплексный механизм регуляции сложился в ответ на требования быстро приспосабливаться к среде и немедленно реагировать на появление или исчезновение питательных веществ. Конечно, многие эукари-отические микроорганизмы ведут себя приблизительно так же, но большинство эукариот — это многоклеточные организмы — растения и животные. Их клетки живут в окружении других клеток того же организма в мало меняющейся среде. У человека имеются системы контроля (например, нервная и гормональная), поддерживающие постоянные состав крови и других тканей, температуру, кровяное давление и другие характеристики. Некоторые клетки, конечно, вынуждены реагировать на быстрые изменения (как, например, клетки печени), но среда большинства клеток меняется незначительно. Скопления клеток в той или иной ткани вырабатывают специфические белки, придающие им отличительную форму и способствующие выполнению специфической функции. Следовательно, главный вопрос регуляции генов растений и животных касается того, о чем мы говорили в начале главы, а именно: каким образом зигота становится взрослым организмом. Об этом мы и поговорим далее, на примере животных.

О регуляции генов бактерий с их репрессорами и операторами забывать не стоит, потому что это прекрасная общая модель: экспрессию генов регулируют особые белки, которые связываются с ДНК на специфических регуляторных участках. Однако, детали механизма регуляции эукариот могут значительно отличаться от механизма регуляции у бактерий. Обычно отдельный ген регулирует сам себя, а не блок генов в виде оперона. У каждого гена имеется свой промотор, и он регулируется комплексом белков, которые связываются с промотором и друг с другом. Такая регуляция порой становится невообразимо сложной. В клетках эукариот содержатся общие белки, которые связываются со всеми промоторами и инициируют транскрипцию; кроме того, в них есть более или менее специфичные белки для различных классов генов. Все эти белки нагромождаются друг на друга на участке промотора, и только когда все они на месте, молекула РНК-полиме-разы связывается с промотором и начинает транскрипцию гена. На страницах этой книги нет смысла описывать регуляцию какого-то конкретного гена и его белков, потому что для непосвященного читателя она предстанет как список бессмысленных названий. Важно понять, что решение включить тот или иной ген во время эмбрионального развития, принимается в ходе взаимодействий нескольких регулирующих белков.

Эмбриональное развитие в общих чертах

Эмбрион развивается из одной-единственной клетки — зиготы — и превращается в комплекс многих специализированных клеток. Зигота тотипотентна, то есть после многократного деления она может дать начало любой специализированной клетке, такой как клетка кожи или мозга. Во время развития многие специализированные клетки теряют эту способность, и никакие экспериментальные ухищрения не могут вернуть их в первоначальное состояние. Однако некоторые клетки все-таки могут снова стать тотипотентными. Например, развившаяся клетка из молочной железы дала тотипотентное ядро для зиготы, которая впоследствии стала клонированной овечкой Долли. В организме обычно содержится некоторое количество тотипотентных клеток, называемых стволовыми клетками, которые приходят на смену отмершим развившимся клеткам. В настоящее время стволовые клетки человека используются для лечения различных заболеваний. Получить стволовые клетки нелегко. Легче всего сделать это на ранней стадии эмбрионального развития. При этом эмбрион разрушается, и каждая клетка становится тотипотентной эмбриональной стволовой клеткой. В последние годы не утихают жаркие споры, насколько с этической точки зрения допустимо использовать эмбрионы человека.

При описании эмбрионального развития важно обратить внимание на два ключевых явления. Во-первых, на определенной стадии развития происходит выбор специализации той или иной клетки. В этот момент на молекулярном уровне судьба клетки более или менее определена {детерминирована). Однако детерминированные клетки эмбриона могут выглядеть одинаково, и только позже клетка действительно видоизменяется {дифференцируется), принимая особую форму и начиная вырабатывать комплекс особых белков.

Здесь мы не можем подробно перечислить все стадии превращения зиготы в многоклеточный организм, такой как организм человека. Классическая эмбриология давно уже описала все процессы, но почти не представила никаких объяснений по поводу того, каким образом они происходят. Важно то, что в определенный момент зигота начинает делиться на две, четыре, восемь клеток и более; через некоторое время образуется скопление клеток. Затем формируется полый шар, бластула, с одним слоем клеток, после чего происходит массовое перемещение клеток внутрь шара, и образуется гаструла. Еще через несколько стадий в эмбрионе различаются три слоя: внешняя эктодерма, из которой образуются кожа и нервная система; внутренняя эндодерма, из которой разовьются эпителий кишечника и связанные с ним органы, а также мезодерма между внешним и внутренним слоями, из которой возникнут многие внутренние органы. И хотя ученые идентифицировали некоторые гены, ответственные за разделение функций этих клеток, в целом мы не можем представить полезные примеры поведения генов на ранних стадиях развития. Однако исследователи узнали многое о некоторых отдельных последовательностях развития, вплоть до идентификации вызывающих их отдельных генов. Рассмотрим некоторые из этих деталей, чтобы получить общее представление о том, как гены определяют развитие тканей.

Клетка может получить «приказ» о специализации как снаружи, так и изнутри. Внешние «инструкции», описанные классическими эмбриологами, были названы индукцией. По мере развития эмбриона происходит массовое перемещение клеток из одного места в другое, и клетки одного типа начинают контактировать с клетками другого типа. При этом один тип клеток может посылать инструкции для другого типа клеток. Один из случаев индукции — формирование глаза в голове позвоночного животного, рассмотренный на примере эмбриона цыпленка (рис. 11.1). Ядро центральной нервной системы, которое формируется на относительно ранней стадии развития, представляет собой трубку с расширением в области, которая впоследствии станет мозгом Рис. 11.1. Формирование глаза эмбриона цыпленка начинается с чашечковидного отростка мозга. Чашечка индуцирует внешнюю ткань, и та преобразуется в хрусталик. Если чашечку удалить, то хрусталик не образуется. Если чашечку переместить в другое место, то формирование хрусталика происходит напротив чашечки Глаза начинают формироваться в виде чашечек, отрастающих от мозга. У этих чашечек нет хрусталика, и они посылают приказы некоторым расположенным напротив них клеткам эктодермы, из которых и образуется ткань хрусталика. Если чашечку микрохирургическим способом удалить, то хрусталик в положенном месте не образуется; если же чашечку внедрить в другое место, то хрусталик образуется там.

Индукция, естественно, подразумевает, что некоторые клетки уже хотя бы частично специализировались, поэтому специализацию клеток нельзя объяснять только индукцией. Необходимо обратить внимание также и на внутренние механизмы специализации. Нам известны два вида общих механизмов, при которых специализация зависит от времени или от местоположения.

Регуляция по времени и развитие крыла цыпленка

Прекрасный пример временного механизма — развитие крыла цыпленка (рис. 11.2). Крыло вырастает из задатка конечности, состоящего из клеток мезодермы, покрытых слоем эктодермы, включая апикальную область — растущий кончик задатка. Клетки этого кончика посылают инструкции клеткам мезодермы, и, вероятно, в них имеются какие-то внутренние часы, определяющие порядок инструкций. Дж. X. Льюис, Д. Саммербелл и Льюис Уол-перт проводили эксперименты по удалению кончика и перемещению его на задатки другого возраста.

Если переместить кончик, находящийся на более ранней стадии развития, в задаток, в котором уже сформировались плечевая, лучевая и локтевая кости, то кончик посылает инструкции по повторному формированию этих костей.

Но если переместить кончик более поздней стадии на задаток ранней стадии, то он будет посылать инструкции по формированию конечных фаланг.

Этот эксперимент показывает, что часы апикальной области сначала включают гены, определяющие строение плечевой кости, затем эти гены выключаются и включаются гены формирования лучевой и локтевой костей. После этого они тоже выключаются и включаются гены фаланг.

Рис. 11.2. Нормальное крыло птенца содержит набор костей, обычный для всех позвоночных: плечевая кость (верхняя часть конечности), лучевая и локтевая кости (нижняя часть), кости запястья и фаланги (пальцы). Мезодерма задатка конечности получает инструкции от апикальной области и формирует все эти кости по очереди. Если апикальную область ранней стадии переместить на конечность, в которой уже сформировались некоторые кости, то он будет посылать инструкции по повторному формированию этих костей, так как ее внутренние часы находятся на более ранней стадии Нам пока неизвестен точный механизм этих часов, но, скорее всего, в нем участвуют регуляторные белки, которые на некоторое время связываются с определенными генами и запускают производство белков следующего вида.