Гуттман Б., Гриффите Э. и др. - Генетика

Между основаниями существуют слабые водородные связи, в которых слегка отрицательно заряженные атомы О и N связаны между собой посредством водорода (имеющим небольшой положительный заряд). Основания, которые связываются друг с другом, называются комплементарными друг другу; это значит, что их форма соответствует друг другу, как рука соответствует перчатке или ключ — замку. Именно комплементарность оснований определяет механизм наследственности, а через него и все основные законы биологии. Модель Уотсона и Крика объясняла правило Чаргаффа, и благодаря ей стало возможным понять, каким образом ДНК переносит генетическую информацию. Короткая заметка Уотсона и Крика в журнале «Nature» за 1953 год скромно обещала некоторые перспективы в исследовании ДНК, но в действительности произвела грандиозную революцию в науке.

Модель днк и генетика

В отличие от работы Менделя, статья Уотсона и Крика сразу же привлекла внимание научного сообщества, поскольку она объясняла механизм наследственности. Сразу становилось понятно, что последовательность оснований ДНК может передавать информацию, то есть служить генетическим кодом. Информация обычно представляет собой последовательность, например последовательность букв и знаков препинания на письме или последовательность точек и тире в азбуке Морзе. Кроме того, генетический код должен как-то передаваться от одной копии ДНК другой в ходе деления клетки. Процесс получения двух копий (или реплик) изначальной молекулы ДНК называется репликацией, и модель Уотсона—Крика объясняет, как это возможно.

В каждой молекуле ДНК одному нуклеотиду соответствует комплементарный ему нуклеотид, и одна цепь ДНК целиком комплементарна другой. Репликацию выполняет сложный фермент ДНК-полимераза, которая начинает разрывать двойную спираль, словно застежку-молнию, оставляя по одному основанию на каждой цепи (рис. 7.7). Здесь мы приведем лишь крайне упрощенное описание процесса.

Рис. 7.7. При репликации ДНК комплекс ферментов разъединяет цепи двойной молекулы, и каждое открытое основание привлекает к себе комплементарный нуклеотид. Этот процесс продолжается, пока из двух цепей не вырастут две идентичные молекулы В действительности все происходит гораздо сложнее, особенно если учитывать, что цепи ДНК могут расти только с 3'-конца. Суть процесса сводится к тому, что молекулы ДНК-полимеразы движутся вдоль каждой цепи и синтезируют комплементарные цепи, образуя таким образом двойную спираль вместо одинарной. Каждое свободное основание связывается исключительно с комплементарным нуклеотидом. Например, открытый цитозин привлекает к себе новый гуанин, а открытый аденин — тимин. В клетке содержится достаточно свободных нуклеотидов, потому что в процессе метаболизма они образуются постоянно, и полимераза связывает парные основания вместе. Так, каждая цепь определяет формирование комплементарной ей цепи с последовательностью, идентичной последовательности прежней парной цепи. В конечном счете получаются две спирали, идентичные начальной молекуле.

Нуклеотидная последовательность ДНК должна хранить генетическую информацию, и последнее предположение, вытекающее из модели Уотсона— Крика, состоит в том, что мутации происходят в тех случаях, когда одно основание заменяется на другое или когда цепь рвется и перестраивается. Такое случается редко, но если происходит, то в клетке имеются механизмы исправления некоторых ошибок. Тем не менее в каждом организме содержится огромное количество ДНК, и если вероятность вставки ошибочного основания равна только одной миллионной, то на каждые 10 миллионов оснований будет приходиться 10 ошибок, и мутация становится силой, с которой следует считаться. Природа мутаций более подробно описана в гл. 14.

Проверка модели

Настоящая научная ценность модели измеряется тем, что можно на практике проверить все выводы, к которым она приводит. Модель Уотсона— Крика не только вобрала в себя все известные факты о ДНК и наследственности, но и позволила высказать ряд новых предположений.

Рассмотрим репликацию ДНК с общей точки зрения. Каждая цепь остается нетронутой, но две цепи одной молекулы расходятся, и к каждой старой цепи пристраивается новая. Это называется полуконсервативной репликацией ДНК, потому что вся родительская ДНК целиком не сохраняется, но остается каждая из ее цепей. Предположим, что начальная молекула окрашена в красный цвет, а новые нуклеотиды — в зеленый. Тогда после репликации каждая дочерняя молекула будет наполовину красной и наполовину зеленой. Если они снова подвергнутся репликации, то из получившихся молекул две по-прежнему будут наполовину красными и наполовину зелеными, а две — полностью зелеными. Обозначим изначальную молекулу сплошными линиями, а новые — прерывистыми. Получается следующая схема:

В 1954 году Мэтью Меселсон и Франклин Сталь из «Калтека» придумали способ проверить эти выводы. В совместной работе с Джеромом Виноградом они открыли, что густой раствор хлорида цезия (CsCl) при центрифугировании на большой скорости образует градиент плотности. Инструмент, называемый ультрацентрифуга, может развивать скорость до 60 тыс. оборотов в минуту, то есть до 1000 оборотов в секунду. Судя по тем относительно медленным центрифугам, которые бывают в парках развлечений, можно представить, какая центробежная сила образуется в мощной центрифуге! Под воздействием этой силы довольно тяжелые ионы цезия начинают перемещаться ко дну центрифужной пробирки. После нескольких часов центрифугирования в растворе CsCl образуется непрерывный градиент плотности, то есть ближе к дну плотность увеличивается, а к поверхности уменьшается. В таком растворе молекулы ДНК останавливаются в том месте раствора, плотность которого равна их плотности.

Меселсон и Сталь выращивали бактерии в среде с содержанием тяжелых изотопов азота (15N в отличие от обычного 14N). Клетки включали этот азот в свои ДНК, то есть их ДНК становились плотнее обычных ДНК. Таким образом, эти ДНК становились мечеными («красными» в нашем примере). Потом исследователи переносили бактерии в среду с обычной концентрацией азота, и поэтому все новые ДНК, образовавшиеся после этого, имели обычную плотность (в нашем примере «зеленые»). Через различные интервалы времени исследователи подвергали пробы ДНК центрифугированию в растворе CsCl и определяли их плотность (в ультрацентрифуге были оптическая система и фотокамера). Сначала все ДНК были плотными. После первого деления они стали наполовину плотными. После второго деления половина ДНК была наполовину плотной и половина ДНК была легкой. Именно так и должна была вести себя ДНК согласно модели Уотсона—Крика.

Второй вывод заключался в том, что при репликации ДНК должна наблюдаться «развилка». Две цепи не могут разделяться сразу по всей длине; они разрываются с какого-то конца, и к разъединившимся участкам пристраиваются новые цепи. Молекулы ДНК можно разглядеть при помощи авторадиографии — метода, при котором регистрируют распределение радиоактивных изотопов в молекуле. При этом часто используют тритий (3Н), изотоп водорода, потому что его атомы при распаде испускают электроны с малой энергией, которые легко поглощаются многими веществами. Если такой электрон попадает на фотографическую пленку или гель, то на ней остается темное пятно, указывающее на местоположение атома трития. Изображение, полученное от распада многих атомов, называется авторадиографией, потому что радиоактивное вещество как бы само себя фотографирует.

Авторадиографии ДНК получают, выращивая некоторые клетки (такие как бактерии или быстро растущие корни растений) в среде, содержащей тимидин (один из нуклеотидов ДНК с пиримидиновым основанием — тимин), помеченный тритием. Тритий, таким образом, включается во все вновь образующиеся ДНК. Затем материал тонким равномерным слоем располагают на пленке (корне растений, к примеру), тщательно раздавливают и распределяют. После промывки и удаления тимидина пленку покрывают фотоэмульсией и оставляют в темном месте, иногда на несколько месяцев. При проявлении эмульсии на пленке возникают темные зерна серебра в тех местах, где распадались атомы трития. Так на фотографии можно опознавать меченые клетки и их части.

В ряде опытов в среде с тритием выращивали бактерии Е. coli и после осторожно выделяли из них молекулы ДНК, растворяли их в воде, заставляя распрямляться на поверхности, и медленно осаждали раствор на фильтровальной бумаге. Такая техника показала, что молекула представляет собой кольцо с длиной окружности более 1 мм, то есть в тысячу раз больше клетки, в которой она обычно упакована. Хромосомы, как правило, оказывались в процессе репликации, и на авторадиографиях видны две точки ветвления, там, где ДНК-полимера-зы движутся в противоположных направлениях. Так модель Уотсона—Крика была подтверждена экспериментальными наблюдениями, хотя практика преподнесла и свои неожиданности.

Единственная хромосома Е. coli составляет весь без исключения геном этого организма. Это относительно маленький геном, хотя в нем и содержится около 3,8х106 нуклеотидных пар. Следует, кстати, упомянуть о том, что молекулярные генетики часто не слишком аккуратно подходят к измерению молекул ДНК. Собственно говоря, основная единица — это нуклеотидная пара (н.п.), но ее отождествляют с основанием (базой) и измеряют длину ДНК в базах или килобазах (kb), то есть в тысячах баз, или нуклеотидных пар.

Глава восьмая. Строение гена

Итак, мы уже знаем, что ген — это фрагмент ДНК, расположенный на хромосоме и определяющий структуру полипептидной цепи. В гене могут происходить мутации, и о том, что гены существуют, мы узнали во многом именно благодаря мутациям. Мутации часто приводят к потере фермента, поэтому мы знаем, что существуют нормальные гены и нормальные ферменты, а также то, что гены передают информацию о постройке ферментов следующему поколению организмов. Остается только выяснить, как устроены сами гены и как они функционируют. В этой главе мы покажем, как с помощью генетического анализа можно подробно изучить строение генов и понять, как с их помощью в клетке создаются белки.

Распределение генов

То, что гены расположены в хромосомах, казалось бы, не соответствует тому факту, что у людей только 23 пары хромосом и вместе с тем тысячи различных признаков, которым должны соответствовать тысячи различных генов. Одних только признаков, сцепленных с Х-хромосомой, несколько сотен, а на самой короткой аутосоме расположены также сотни генов. Как это согласуется с менделевским законом независимого распределения признаков? Это значит, что закон независимого распределения признаков применим только для генов, расположенных на разных хромосомах; сначала ученым необходимо было определить основные законы и выяснить природу наследственности на примере простейших признаков. На самом деле многие гены расположены на одной и той же хромосоме, поэтому они, как правило, наследуются вместе. Такие гены называются сцепленными. Одно из достижений современной генетики и заключается в том, что созданы карты сцепления для многих признаков. На этих картах показано также относительное положение генов на хромосомах, и мы увидим, что эти карты имеют не только теоретическое, но и практическое значение.

Место, которое ген занимает на хромосоме, называется локусом. За исключением тех редких случаев, когда происходит перестройка хромосомы, у всех представителей отдельного биологического вида каждый ген имеет строго определенный локус. Мы уже говорили, что о существовании генов узнали по мутациям, которые обычно изменяют гены, делая их дефектными или необычными. Большинство наследственных признаков известны по таким наследственным заболеваниям, как гемофилия, дальтонизм и фенилкетонурия. Нормальные аллели гена называются дикими, хотя, как правило, этот термин применим только для некоторых организмов, с которыми проводят опыты. Гены, определяющие такие признаки человека, как цвет глаз или группу крови, обычно дикими не называются. В естественной популяции имеется много аллелей одного гена. Мутантный аллель можно использовать как маркер, помогающий определить местоположение гена. Например, дефектный ген гемоглобина, который вызывает серповидноклеточную анемию, можно использовать как маркер для определения локуса генов гемоглобина вообще. Без такого варианта гена у нас бы было мало возможностей исследовать эти гены.

Генетическая карта хромосомы представляет собой линию, на которой отмечены локусы генов и относительные расстояния между ними, измеряемые в единицах карты. Хотя некоторые методы с использованием микроскопа позволяют ученым непосредственно определить локус гена на хромосоме, обычно устанавливают локус гена относительно других генов. Для этого требуются организмы, гетерозиготные по двум генам, чтобы две маркированные хромосомы могли взаимодействовать друг с другом. Распределение аллелей в этих организмах называется родительской комбинацией. Гены обозначаются буквами на двух линиях хромосом, иногда схему упрощают до одной линии:

Маркеры, обозначенные буквами сверху, располагаются на одной гомологичной хромосоме, а обозначенные буквами снизу — на другой гомологичной хромосоме. Для удобства при печати линии могут обозначаться косыми чертами, например ЛВ/аb. Поясним принцип составления карт на конкретном примере. Допустим, два гена — ген дальтонизма и гемофилии — располагаются на Х-хромосо-ме: с — аллель дальтонизма, С — аллель нормального зрения, h — аллель гемофилии, Н — аллель нормального свертывания крови. Поскольку мы не можем скрещивать людей по своему выбору, нужно собрать данные о тех семьях, в которых жены были гетерозиготны по обоим генам. Маркеры могут находиться в состоянии сопряжения, когда доминантные аллели располагаются на одной хромосоме, а рецессивные — на другой, или же в состоянии отталкивания, когда на каждой хромосоме располагаются доминантный и рецессивный аллели. Для начала рассмотрим случай, когда женщины переносят аллели в состоянии отталкивания, С h/c H. Это значит, что у них на одной Х-хромосоме аллели С и h, а на другой — с и Н. Так как сыновья получают Х-хромосому только от матери, фенотип сыновей сразу же указывает, какую хромосому они унаследовали. В данном случае можно ожидать, что половина сыновей получит ген дальтонизма, но без гена гемофилии (Н с/У), а другая половина — ген гемофилии, но без гена дальтонизма (h C/Y). В действительности же наблюдается следующее распределение:

9 С h/Y : 1 С H/Y : 1 с h/Y : 9 с H/Y.

Получается, что 10% сыновей, которых мы называем рекомбинантами, получили иную комбинацию генов, отличающуюся от комбинации их матерей.

В профазе мейоза гомологичные пары выстраиваются напротив друг друга и удерживаются вместе в хиазмах, то есть в точках, где их хроматиды переплетаются друг с другом. Иногда в точке хиазмы хроматиды разрываются и обмениваются друг с другом сегментами. Такой процесс называется кроссин-говером. Если кроссинговер происходит между локусами двух генов, то аллели этих генов перераспределяются между хромосомами.

Кроссинговер приводит к рекомбинации, и число R, равное отношению числа рекомбинантов к общему числу потомков, называется частотой рекомбинации. Данные гены рекомбинируют с частотой 10% (два рекомбинанта из 20), то есть R — 0,1.

Так как рекомбинация происходит случайным образом, R зависит от вероятности того, что кроссинговер произойдет между двумя генами. Если это расстояние очень короткое, то вероятность рекомбинации будет крайне низка, и два аллеля, скорее всего, останутся на одной хромосоме. Если расстояние между генами большое, то вероятность того, что кроссинговер произойдет в точке, расположенной между ними, повышается и как следствие повышается частота рекомбинации. Таким образом, число R можно принимать за меру расстояния между двумя генами на одной хромосоме. За единицу карты условно принимают 1% рекомбинаций, поэтому, если частота рекомбинации между С и Я равна 10%, то расстояние между этими генами равно 10 единицам. Можно доказать, что частота рекомбинации определяется только расстоянием между генами, а не начальным распределением аллелей на другом примере, где аллели находятся в состоянии сопряжения. Для такого случая имеем следующие данные:

9 С H/Y : 1 С h/Y : 1 с H/Y : 9 с h/Y.

Этого и следовало ожидать: 90% начального расположения аллелей и 10% рекомбинаций.

Определить расстояние между генами человека — достаточно сложно. У большинства организмов, скрещивать которые можно по выбору, весь процесс состоит из двух стадий. Сначала скрещиваются между собой гомозиготы с нужными аллелями и получается гетерозиготное потомство, у которого могут происходить рекомбинации; затем скрещиваются особи второго поколения, и изучается их потомство. У людей первая и вторая стадии соответствуют браку, над которым мы не властны, и поэтому остается только изучать потомков от таких браков.

Установив расстояние между двумя генами, можно по одному добавлять и другие гены. Возьмем для примера ген, маркированный по аллелям Аи а и сцепленный с геном С. Исследуем распределение аллелей у сыновей от женщин с генотипом А с/а С:

43 A c/Y, 7 A C/Y, 8 a c/Y, 42 a C/Y.

Всего получается 15 (7 + 8) рекомбинаций из сотни, то есть 15%. Поэтому ген А можно поместить на хромосомной карте в 15 единицах от гена С. Однако три гена могут располагаться в последовательности Н С А, и в таком случае расстояние между A и H будет равно 25 (10 + 15) единицам, либо они могут располагаться в последовательности А Н С, и в таком случае А и H будут находиться всего в 5 (15 — 10) единицах друг от друга. Для уточнения положения третьего гена следует учесть данные скрещиваний по генам А и Н.

Легче всего определять положение генов, сцепленных с полом, потому что расположение аллелей как минимум одной из Х-хромосом женщины можно определить по Х-хромосоме ее отца, а генотип Х-хромосомы ее сыновей также определяется непосредственно. Построить карту аутосомных хромосом труднее. В наше время созданы превосходные карты для некоторых лабораторных и культурных растений и животных (рис. 8.1), но определить точный генотип человека или хотя бы расположение аллелей (сопряжение или отталкивание) нелегко.

Карты сцепления хромосом человека оказали бы неоценимую помощь генетическому консультанту. Например, одной аутосомной доминантной мутацией Ht вызывается наследственное заболевание — хорея Гентингтона. Для этого заболевания характерно ослабление со временем функционирования нервной системы, особенно после среднего возраста. Если человек болен хореей Гентингтона, то вероятность передать своему ребенку аллель Ht составляет 50%. Можно ли уменьшить вероятность?

Предположим, что существует другой ген с двумя аллелями А и а, расположенный в 5 единицах от Ht, и что определить аллели у каждого человека легко. Допустим, у больного отца будущего ребенка Генотип A Ht/a ht, а у нормальной матери генотип ht a/ht а Рис. 8.1. Генетическая карта плодовой мушки Drosophila melanogaster . На основании этих данных можно уточнить вероятность передачи дефектного гена. Ребенок, гомозиготный по а, с вероятностью в 95% не будет иметь Ht, потому что Ht у больного родителя связан с А и может отделиться лишь в 5% случаев. Точно так же и для ребенка с аллелем А существует вероятность 95%, что он унаследует Ht. Конечно, родителям было бы полезно узнать, переносят ли они еще не проявивший себя аллель Ht и с какой вероятностью передадут его своим детям.

Но здесь мы опять подходим к неизбежному вопросу, какую ценность имеет знание, что человек переносит ген, способный вызвать умственную отсталость у его детей или даже послужить причиной их ранней смерти. Многие предпочли бы не знать этого и в свободном обществе они имеют полное на то право. (Право на незнание стали рассматривать в недавнее время, в связи с развитием современной науки.) Однако некоторые люди были бы этому рады; такое знание избавило бы их от пугающей неопределенности и помогло бы оценить шансы завести здоровое потомство. Кроме того, медицина постоянно развивается, и появляются новые методы лечения наследственных нарушений, которые могут проявиться в более позднем возрасте, так что со временем ценность знания, что человек является переносчиком того или иного аллеля, будет только повышаться.