Гуттман Б., Гриффите Э. и др. - Генетика

Сложные гены эукариот

Когда исследователи начали изучать гены различных белков в клетках эукариот, обнаружилось, что взаимодействие генов и белков в этих организмах более сложное, чем взаимодействие генов и белков прокариот. Первые примеры такого взаимодействия были получены в 1977 году в лабораториях Филипа Шарпа и Пьера Шамбона. Вместе со своими коллегами они гибридизировали мРНК различных генов с теми ДНК, с которых были сняты эти информационные копии. У бактерий последовательность мРНК идентична последовательности кодирующей цепи ДНК (за исключением того, что место тимина занимает урацил), поэтому структура гибридных молекул была достаточно проста.

Рис. 9.5. Общие принципы синтеза белка. Информационная (матричная) РНК входит в рибосому так, чтобы первые два ее основания могли соединиться с двумя молекулами ами-ноацил-тРНК. К этому участку подходят две аминоацил-тРНК, кодоны, которых комплементарны кодонам мРНК. Затем первая аминокислота соединяется со второй пептидной связью, первая тРНК отсоединяется, и дипептид остается прикрепленным ко второй тРНК. Вместе с тем мРНК сдвигается на следующий «шаг» в рибосоме, после чего к ее третьему кодону может присоединиться третья тРНК. Между второй и третьей аминокислотой образуется пептидная связь, и весь процесс повторяется (обычно несколько сотен раз) до кодона мРНК, означающего остановку, после чего сформированный белок отсоединяется Но когда под электронным микроскопом были сделаны снимки гибридных молекул генов эукариот, то в них обнаружился ряд петель. Это значит, что мРНК и ДНК имеют не совсем идентичную последовательность, и петли были как раз теми местами, в которых они не могли соединяться. Когда последовательность мРНК сравнили с последовательностью ДНК, стало понятно, что кодирующая последовательность генов в некоторых местах прерывается некодирующей последовательностью, то есть некоторые нуклеотиды не кодируют синтез белка. Впоследствии выяснилось, что это типичная картина для ДНК эукариот. Кодирующая последовательность гена называется эк-зоном, а некодирующая последовательность — ин-троном. Некоторые гены имеют в своей структуре несколько интронов. Часто обнаруживают и такие гены, в которых больше интронов, чем экзонов.

В общем случае при транскрипции генов эукариот образуются большие молекулы РНК, содержащие как экзоны, так и интроны. После этого особые комплексы ферментов (сплайсингсомы) вырезают из транскрипта все интроны и соединяют экзоны в одну мРНК, кодирующую производство белка. Далее эта РНК транслируется как обычно.

Причины, по которым природа придерживается такой структуры, до сих пор не ясны, но ее можно объяснить как с эволюционной точки зрения, так и с точки зрения развития организма. Если говорить об эволюции, то такая структура ценна тем, что позволяет экспериментировать с генами и создавать новые гены. Кроссинговер может происходить внутри интронов, и в таком случае ошибки будут несущественными, а при рекомбинации могут образоваться новые экзоны и как следствие новые белки. Часто бывает так, что отдельный экзон кодирует отдельную область, или домен, белка, то есть отдельную часть белка с особыми функциями. Поэтому включение в ген нового экзона приведет к созданию белка с новыми областями и, возможно, с новыми функциями. Такое изменение генетической структуры может служить источником эволюции.

С точки зрения развития организма структура интрон-экзон ценна тем, что позволяет одноц нуклеотидной последовательности кодировать синтез более одного белка. Сейчас известны случаи, когда интроны в разных тканях режутся по-разному, и в результате синтезируются разные белки с разными функциями. Поэтому такая структура предоставляет возможность осуществить рост новых типов клеток с минимальным изменением информации.

Хромосомы эукариот содержат не только избыточную ДНК в виде интронов, но и повторяющуюся ДНК, которая не кодирует белки или стабильные молекулы РНК. Например, около 10% ДНК мыши приходится на ДНК с высоким содержанием повторяющихся элементов, то есть эти участки содержат короткие последовательности, длиной не более 10 нуклеотидных пар, повторяющихся миллионы раз. Еще 20% приходится на ДНК с умеренным содержанием повторяющихся элементов, то есть эти участки содержат последовательности из нескольких сотен нуклеотидов, повторяющиеся тысячи раз. Таким образом, очень большая часть хромосом эукариот состоит из ДНК, которая может подвергаться мутациям и рекомбинациям без выраженного эффекта. (О повторяющейся ДНК в геноме человека говорится в гл. 12.)

Генетический словарь

К 1962 году благодаря работам Крика и его коллег, о которых говорилось ранее, было установлено, что генетический код состоит из триплетов. После этого перед исследователями встала другая непростая задача: определить, какие именно аминокислоты кодирует тот или иной триплет. Как часто бывает, открытие было сделано почти случайно, после чего весь код был расшифрован за несколько лет — одно из величайших достижений молекулярной биологии! В 1961 году Маршалл Ниренберг и Филипп Ледер разрабатывали методы искусственного синтеза белка, смешивая рибосомы, источники энергии, активирующие ферменты, тРНК и другие компоненты. В одну из контрольных смесей, синтез белка, в которой не ожидался, они добавили искусственную РНК, состоявшую исключительно из ураци-ла, то есть полимера с нуклеотидной последовательностью U—U—U—U—U-, называемого полиури-диловой кислотой. Вопреки ожиданиям эта кислота повела себя, как информационная РНК, и стимулировала синтез белка. В такой среде с полиуридило-вой кислотой синтезировался только полифенил-аланин, то есть последовательность U—U— U должна была кодировать производство одной аминокислоты, а именно фенилаланина.

После этого открытия началось настоящее состязание между лабораториями Ниренберга и Северо Очоа, в которых с помощью синтетических РНК старались подобрать код к каждой аминокислоте. Поскольку фермент, создающий такие синтетические молекулы, соединяет основания в случайной последовательности, поначалу приходилось полагаться на статистический анализ получающихся полипептидов. Настоящий прорыв был сделан только тогда, когда Ниренберг и Генрих Матей попытались синтезировать мини-мРНК с тремя нуклеотидами в известной последовательности. Обнаружилось, что в искусственной среде каждый из этих триплетов присоединялся к рибосоме и распознавался только одним видом тРНК. Исходя из этого, легко было узнать, какие аминокислоты кодировались тем или иным триплетом. Исследователи выяснили, что UUU и UUC (если читать их в направлении 5>3'), например, присоединяют к себе тРНК фенилаланина, GUU — тРНК валина, UUG — тРНК лейцина, a UGU присоединяет тРНК цистеина. В конце концов с помощью ученых из других лабораторий был расшифрован генетический код всех аминокислот и получен своеобразный «генетический словарь» (табл. 9.1).

На основании приведенной таблицы можно сделать ряд выводов. Как и предсказывал Крик, код оказался вырожденным, но при этом количество кодонов, определяющих ту или иную аминокислоту, варьируется от одного (метионин, триптофан) до шести (лейцин, серии, аргинин). Кроме того, вырожденность кода довольно регулярна. В любом случае весь смысл определяют два первых основания (в направлении 5'>3').

Примечание. Каждый из 64 триплетов либо кодирует одну из aivfti-нокислот (обозначенных трехбуквенными сокращениями), либо означает конец синтеза полипептидной цепи.

В восьми случаях не имеет значения, какое за ними следует третье основание, так как аминокислота определяется и без него. В 12 случаях смысл определяет выбор между пурином (A, G) или пиримидином (U, С).

Триплет AUG, кодирующий метионин, в начале гена почти всегда используется для специальной тРНК, переносящей метионин с блокированной аминогруппой (N-формилметионин). В другие места белка метионин переносит другая тРНК.

Колинеарность генов и белков

Гипотезу о колинеарности гена белку можно было подтвердить, показав, что последовательность мутаций гена соответствует изменениям последовательности аминокислот, к которым приводят эти мутации. Для этого необходим ген с известной картой, кодирующий белок, последовательность которого также известна. Чарльз Янофски в этих целях исследовал гены ферментов, синтезирующие триптофан (trp-гены) в Е. coli. Янофски с коллегами использовал ген trpA, кодирующий производство белка А, часть фермента триптофансинтетазы. Исследователи определили полную последовательность из 267 аминокислот в белке А дикого типа и в 10 белках-мутантах по локусу trpA. Каждая мутация заменяла во всем белке только одну аминокислоту. Они составили также карты мутационных участков для 10 мутантов и показали, что последовательность мутационных участков и последовательность заменяемых аминокислот в мутантных белках соответствуют друг другу рис. 9.6. Генетическое расстояние между двумя участками мутаций пропорционально расстоянию между аминокислотами, на которые они воздействуют, так что генетическое расстояние, определяемое в результате рекомбинаций, действительно соответствует физическим расстояниям внутри гена. Обратите внимание на то, что в двух случаях два аллеля, выделяемые на основе рекомбинаций, соответствуют разным заменам одной и той же аминокислоты. Обычный глициновый остаток в позиции 210 у мутанта А23 заменяется на глутамин, а у мутанта А46 — на глутаминовую кислоту. Согласно генетическому коду глицину соответствует кодон GGX (где X обозначает А или G), и у мутанта А23 он заменяется на кодон CGX, а у мутанта А46 — на GAX.

Рис. 9.6. Колинеарность гена и синтезируемого им белка. Последовательность мутационных участков в ДНК идентична последовательности аминокислот белка. В двух случаях соседние мутации определяют разные замены одной и той же аминокислоты Мутации А78 и А58 также по-разному затрагивают один и тот же кодон. Таким образом, ген состоит из линейной последовательности кодонов, определяющей последовательность аминокислот, и кодирующий элемент каждой аминокислоты может в результате рекомбинаций разделяться на части.

Этот впечатляющий генетический эксперимент был подтвержден другим замечательным экспериментом Джорджа Стейзингера и его коллег. Они получили мутанты фага Т4, производящие мутант-ный фермент лизоцим, и выделили синтезируемые ими белки, определив последовательность аминокислот. Под воздействием профлавина они вызвали мутации этого гена и получили супрессор. Белок двойного мутанта оказался почти дикого типа, за исключением небольшого бессмысленного набора аминокислот, соответствующих бессмысленному набору оснований между двумя мутационными участками. Это было изящное и логичное продолжение работы Крика.

Все описанные генетические опыты помогли ученым разработать модель работы гена. Они проводились независимо от биохимических исследований и вместе с тем подтвердили, что код ДНК транслируется в структуру белка.

Терминирующие кодоны

Три код она из 64 не служат кодом для аминокислоты. Они означают конец синтеза белка и называются терминирующими или нонсенс-(стои-) ко-донами (stop codon). Их существование было подтверждено нонсенс-мутациями, которые приводили к образованию именно таких кодонов. Обычно эти триплеты располагаются в конце гена, но если в результате мутации один из терминирующих кодонов оказывается внутри гена, то синтез белка немедленно прерывается. Одна из серий нонсенс-мутаций, а именно амбер-мутации, по определению имеет дефекты, супрессором которых может быть другая мутация, затрагивающая механизм синтеза белка. В результате супрессорной мутации образуется тРНК, способная распознавать нонсенс-кодон и вставлять в полипептидную цепь аминокислоту, делая тем самым этот кодон смысловым. Секвени-рование нормальных белков показало, что амбертриплет может образовываться только в результате мутации кодонов UGG, UAG и CAG, исходя из чего, был сделан вывод, что амбер-триплет — это UAG. Такая картина мутации подтверждает данные, полученные в ходе биохимических исследований.

Универсальность кода

Значение кодонов было выяснено в ходе опытов на бактериях Е. coli. Но что если в генах других организмов, в том числе и человека, используется другой шифр? В таком случае мутации белков человека не должны были бы соответствовать заменам оснований в кодонах, опознанных на примере Е. coli. Однако многочисленные эксперименты показали, что в генах различных организмов используются одни и те же кодоны и что генетический код во всех случаях один и тот же. (Правда, были обнаружены некоторые незначительные исключения. В митохондриях и хлоропластах имеются свои ДНК, которые определяют синтез некоторых их компонентов, и в этих ДНК встречаются несколько иные варианты кодонов.) Иными словами, получается, что мы можем искусственным образом синтезировать белки с использованием компонентов различных организмов: взять, например, мРНК дрозофилы и с помощью синтезирующего механизма растений получить белок дрозофилы. Таким образом, генетический код и механизм синтеза белков универсальны для всего живого. Универсальность генетического кода послужила одним из первых экспериментальных доказательств того, что все формы жизни на нашей планете происходят от общего предка. Труды великих ученых XIX столетия Чарльза Дарвина и Альфреда Рассела Уоллеса, а также их последователей начала XX века показали эволюционное родство между различными группами организмов. Однако немногие ученые были готовы к тому, что молекулярная генетика в первые же годы своего развития докажет, что от общего предка происходят все живые организмы. Получается, что мы, люди, родственники не только обезьянам или всем животным вообще, но и растениям, грибам и бактериям. Осознание этого родства всего живого имеет далеко идущие последствия не только для развития биологии, но и для всего человечества.

Так была подготовлена почва для появления молекулярной инженерии, которая обещает коренным образом изменить взаимодействие человека и природы. Как именно будет происходить подобное вмешательство и каковы могут быть его последствия, обсуждается в гл. 12. Но перед этим мы более подробно рассмотрим генетическую систему бактерий, которые служат основным орудием генетических манипуляций.

Глава десятая. Наследственностb в мире бактерий

Представители классической генетики едва ли смели мечтать о тех возможностях, какие открываются перед современными учеными, проводящими эксперименты на бактериях и вирусах бактерий. В этой главе мы познакомимся с некоторыми результатами их работ и принципами, согласно которым функционирует генетический аппарат не только бактерий, но и всех живых организмов. Мы узнаем также о перспективах современной генетики и получим представление о вопросах, какие она ставит перед человечеством. Способы клонирования ДНК, воспроизводства ее последовательности, а также создания генетически модифицированных организмов были впервые опробованы в исследованиях по генетике бактерий и вирусов.

Бактерии-мутанты

Разные виды бактерий можно различать по фенотипическим признакам, таким как форма, цвет и другие характерные подробности их колоний. Но большой прогресс в генетике бактерий был достигнут в ходе исследований мутантов одного вида, преимущественно Е. coli, отличающихся от обычных представителей незначительными чертами. Некоторые из наиболее полезных мутантов имеют фенотип, зависящий от условий, и это значит, что в так называемых пермиссивных (разрешительных) условиях они демонстрируют дикие признаки, но в других, рестриктивных (ограничивающих, или неблагоприятных) условиях у них регистрируется иной фенотип. Например, мутанты, чувствительные к температуре, обычно растут при низких температурах (например, при 28°С), но не могут расти при высокой (42°С) температуре. Мутанты, чувствительные к холоду, напротив, не растут при низкой температуре. Так, регулируя температуру, мы можем способствовать росту одних штаммов и замедлять рост других. Другим штаммам необходима питательная среда с особыми компонентами. Как было показано в гл. 6, клетки дикого типа, называемые прототрофами, могут сами производить необходимые компоненты из простых питательных веществ, таких как сахар, а мутанты ауксотрофы не могут расти без добавления в среду некоторых сложных веществ. Например, мутанты trp не могут производить одну из аминокислот — триптофан, и поэтому растут только при наличии в питательной среде триптофана. Другие штаммы устойчивы к антибиотикам, убивающим дикие бактерии; дикие клетки strs чувствительны к стрептомицину, а мутанты strr устойчивы к нему.

Бактерии можно легко перемещать при помощи пипеток или стерильных проволочных петель и выращивать их в чашках Петри для наблюдения и выявления признаков. Среди самых важных методов генетического анализа можно назвать скрещивание разных штаммов, так как у бактерий имеется нечто вроде полового размножения. Открытие пола и полового размножения бактерий — сама по себе занимательная история.

Пол у е. СоlI

В 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Тэйтем принялись ставить генетические эксперименты на бактериях. Несколькими годами ранее Тэйтем работал в сотрудничестве с Джорджем Биллом, и они на основе опытов с плесенью Neurospom выдвинули теорию «один ген — один фермент», оказавшую столь большое влияние на развитие генетики. Ледерберг и Тэйтем надеялись при помощи более простых организмов сделать еще более грандиозное открытие. Лурия и Дельбрюк к тому времени уже доказали, что бактерии подобно другим организмам могут мутировать и образовывать разные штаммы, полезные в исследованиях. Однако для генетических экспериментов требуется скрещивать различные линии организмов с половым размножением, тогда как у бактерий, как считали в то время, пола нет. Ледерберг и Тэйтем предположили, что если бы у бактерий имелся пол, то разные клетки с разным генотипом скрещивались бы между собой и давали рекомбинантов, как и более высокоразвитые организмы. Поэтому если обнаружить рекомбинантные организмы, то это будет доказательством того, что у бактерий имеется нечто вроде полового размножения. Они предположили, что даже в этом случае количество рекомбинантов будет очень малым, и поэтому нужно постараться вывести рекомбинантов между двумя ауксотрофными штаммами. Один из штаммов для своего роста требует треонин и лейцин, но может производить свои метионин и тиамин (генотип thr--leu--met+hti); другой штамм может вырабатывать треонин и лейцин, но требует метионин и тиамин (генотип thr+leu+met~thi~). При смешении этих штаммов действительно обнаруживались прототрофы, которые могли образоваться только в результате рекомбинации.

Леденберг обнаружил, что рекомбинации могут происходить только между некоторыми фертильными штаммами, которые он обозначил F+, и другими штаммами с довольно низкой частотой, которые он обозначил F--, притом с довольно низкой частотой. Фертильность у бактерий — это нечто вроде инфекции, потому что когда клетки F--смешиваются с клетками F+, они преобразуются в клетки F+. Такое странное явление прояснили эксперименты Уиляма Хэйза из Великобритании, Франсуа Жакоба и Эли Вуллмана из Франции и Л. Л. Кавалли из Италии. Сначала они открыли, что клетки F+ содержат генетический фактор, названный ими F-фактором, или фертильным фактором. Как мы увидим далее, F-фактор представляет собой отдельную молекулу ДНК. При контакте с другими клетками клетки F+ способны передавать копии своих F-фак-торов другим клеткам, преобразуя их в клетки типа F+. С низкой вероятностью они могут заодно передавать и некоторые свои гены клеткам F--, и так происходят рекомбинации. Затем Хэйз и Кавалли открыли вариант штамма F+, названный Hfr (high frequency of recombination — «высокая частота рекомбинации»), который передает свои гены клеткам F-- с довольно высокой частотой. Механизм рекомбинации стал ясен после скрещиваний прототрофного штамма Hfr, чувствительного к стрептомицину, со множественным ауксот-рофным штаммом F--, устойчивым к антибиотику, и с генотипом strrthr~leu~met~lac~gal~thi~. Каждый ген означает метаболический недостаток, например, неспособность синтезировать треонин {thr-) или неспособность расти на лактозе (lac-). При смешивании клетки Hfr и F- спариваются в процессе конъюгации (слияния). Через некоторое время их помещают в среду со стрептомицином, чтобы убить клетки Hfr и проверить, какие дикие гены клетки F- унаследовали от клеток Hfr. В ставшем классическом эксперименте Жакоб и Вуллман через разные промежутки времени брали образцы конъюгирующих клеток и разделяли их в смесителе, после чего выращивали в различных средах и определяли унаследованные гены. Этот эксперимент показал, что каждый маркер Hfr начинает проявляться через строго определенный промежуток времени: ген В только через семь минут, ген С — через девять, ген D — только через 15 минут и т. д. Отсюда следует, что Hfr передает клеткам F- гены в линейной последовательности, то есть в той последовательности, в которой они соединены в хромосоме бактерий.