Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

Следствием этого является передача электронов от НАД-H2 на фосфодиоксиацетон, восстановление его до 3-фосфоглицерина и дефосфорилирование последнего, приводящее к образованию глицерина. Кроме глицерина в среде происходит накопление ацетальдегида (в комплексе с бисульфитом), этанола и CO2, но образование последних двух продуктов заметно подавлено. Когда брожение идет в присутствии бисульфита, энергетический выход процесса в два раза меньше по сравнению с нормальным спиртовым брожением, поскольку одна триоза не подвергается окислению, а восстанавливается до молекулы глицерина.

Спиртовое брожение протекает обычно при pH 3–6. Если его проводить в щелочной среде, например в присутствии NaHCO3, также происходит накопление в сбраживаемом растворе глицерина. Оказалось, что в щелочных условиях ацетальдегид не может акцептировать электроны, поскольку в этих условиях он участвует в реакции дисмутации с образованием уксусной кислоты и этилового спирта. Акцептором электронов, как и в предыдущем случае, служит фосфодиоксиацетон. Процесс брожения в щелочной среде можно представить в виде следующего уравнения:

Микроорганизмы, осуществляющие спиртовое брожение

Накопление этилового спирта в среде в анаэробных условиях наблюдается у разных групп эубактерий и группы эукариотных микроорганизмов — дрожжей.

Эубактерии

Способность осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение по пути, описанному в предыдущем разделе, присуща некоторым эубактериям, принадлежащим к разным таксономическим группам, например Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora.

S. ventriculi относится к группе грамположительных анаэробных кокков. Клетки неподвижные; делятся в трех плоскостях, поэтому в культуре часто образуют пакеты, состоящие из 64 и более клеток. Веществом, связывающим клетки в пакетах, служит целлюлоза. Описана способность образовывать эндоспоры. Аэротолерантный анаэроб. Единственный способ получения энергии — сбраживание Сахаров. Потребность в питательных веществах довольно высока (многочисленные аминокислоты и ряд витаминов).

E. amylovora относится к группе энтеробактерий. Это грамотрицательные подвижные палочки. Особенностью вида является его патогенность для растений. Факультативный анаэроб. В аэробных условиях получает энергию в процессе дыхания.

Помимо этилового спирта и CO2 в качестве продуктов брожения S. ventriculi в среде накапливается уксусная кислота и выделяется молекулярный водород, у E. amylovora накапливается молочная кислота. Разнообразие конечных продуктов у этих бактерий связано с тем, что пируват, образующийся при сбраживании глюкозы по гликолитическому пути, далее может метаболизироваться различно: восстанавливаться до молочной кислоты; подвергаться декарбоксилированию и последующему восстановлению, как описано в предыдущем разделе; подвергаться ферментативному расщеплению, приводящему к образованию ацетата и др.

У многих клостридиев и энтеробактерий среди продуктов брожения обнаруживают этиловый спирт, но путь его образования отличен от описанного в предыдущем разделе. Сбраживание сахаров до пировиноградной кислоты происходит по гликолитическому пути, дальнейшее же превращение пирувата идет не через пируватдекарбоксилазу. У названных групп бактерий пируват подвергается расщеплению, приводящему к образованию ацетил-КоА. Реакция катализируется пируватдегидрогеназой. Ацетил-КоА затем восстанавливается до ацетальдегида:

CH3-CO~S-КоА + НАД-H2 ® CH3-COH + НАД+ + КоА-SH, а последний — до этанола.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии накапливают в среде спирт, метаболизируя глюкозу по окислительному пентозофосфатному пути. В результате ряда ферментативных превращений образуется ацетилфосфат, восстановление которого в два этапа приводит к появлению молекулы этилового спирта.

Наконец, у бактерий Zymomonas mobilis с неясным систематическим положением, используемых в Мексике для получения национального спиртного напитка "пульке", разложение глюкозы до пировиноградной кислоты идет по пути Энтнера — Дудорова. Дальнейшее превращение пирувата происходит с участием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Выход продуктов брожения такой же, как при спиртовом брожении по гликолитическому пути: по 2 молекулы спирта и CO2 на 1 молекулу сброженной глюкозы, но энергетический выход в два раза ниже, чем при гликолизе: всего 1 молекула АТФ на 1 молекулу сброженной глюкозы.

Z. mobilis — грамотрицательные подвижные бактерии, имеющие форму коротких палочек. Характеризуются высокими биосинтетическими способностями. Анаэробы, единственный способ получения энергии для которых — спиртовое брожение. Однако эти бактерии способны расти в присутствии молекулярного кислорода. Последний в этом случае используется для окисления части этанола до уксусной кислоты в соответствии с уравнением:

1 глюкоза + 1O2 ® 1 этиловый спирт + 1 уксусная кислота + 1,7CO2 + 0,2 молочная кислота Таким образом, молекулярный кислород существенно не меняет характера энергетического метаболизма Z. mobilis. В клетках бактерии обнаружены фрагменты ЦТК, цитохромы b, c, a2, каталаза. Наиболее вероятным представляется, что предки Z. mobilis — аэробы. Способ получения энергии за счет спиртового брожения — более позднее приспособление к условиям обитания.

Эукариоты

Основными продуцентами этилового спирта, имеющими широкое практическое применение, являются дрожжи — одноклеточные эукариотные микроорганизмы, принадлежащие к разным классам высших грибов. Наиболее распространенный способ размножения дрожжей — почкование. Дрожжи — аэробы со сформированным аппаратом дыхания, но в анаэробных условиях осуществляют спиртовое брожение по пути, рассмотренному в предыдущем разделе, т. е. получают энергию за счет субстратного фосфорилирования. Конструктивный метаболизм дрожжей основан на их хорошо развитых биосинтетических способностях. Есть виды дрожжей, развивающиеся на простых синтетических средах; эти дрожжи способны синтезировать все необходимые им сложные органические соединения. Существуют виды,. нуждающиеся в определенных витаминах группы В. Добавление к питательной среде веществ, содержащих комплекс витаминов, аминокислот, сахаров приводит, как правило, к заметному стимулированию роста дрожжей.

Ряд отраслей промышленности основан на жизнедеятельности дрожжей (виноделие, производство спирта, пивоварение, хлебопекарное производство). Сырьем для производства спирта с использованием дрожжей служат углеводы растительного происхождения (картофель, злаки), отходы пищевой (мелассы) и целлюлозно-бумажной (щелока) промышленности, различные сельскохозяйственные отходы, а также гидролизаты древесины. Сбраживание дрожжами виноградного сока лежит в основе виноделия; сбраживание пивного сусла, приготовленного из проросших зерен ячменя, специальными пивными дрожжами — в основе пивоварения.

О путях образования этилового спирта

Изложенные данные позволяют составить определенное представление о том, насколько широко распространено образование этилового спирта среди разных групп эубактерий и насколько различны метаболические пути, ведущие к его синтезу. Из этого следует, что накопление в культуральной среде этилового спирта само по себе не может служить указанием на место процесса, приводящего к его образованию, в эволюции. Этиловый спирт у эубактерий может быть одним из конечных продуктов как эволюционно более ранних (гликолиз), так и более поздних (окислительный пентозофосфатный цикл, путь Энтнера — Дудорова) катаболических процессов. До сих пор среди эубактерий не обнаружены организмы, сохранившие черты примитивности энергетического и конструктивного метаболизма, у которых спиртовое брожение служило бы единственным способом получения энергии. Тот факт, что в самом "классическом" виде спиртовое брожение проявляется у дрожжей, форм эукариотных, не может, как нам кажется, ставить под сомнение его место в эволюции анаэробных энергетических процессов.

Пропионовокислое брожение

Из рассмотренных двух типов брожения видно, что ключевым соединением в обоих процессах является пируват, поскольку в конечном итоге специфика брожения определяется дальнейшей судьбой пирувата. Основная задача последующих реакций — регенерирование молекулы НАД+ и возвращение ее в клеточный метаболизм. Прямое восстановление пирувата с помощью НАД-H2 до молочной кислоты реализуется в молочнокислом брожении. Другая возможность регенерирования НАД+ — "сбрасывание" водорода с НАД-H2 на фрагменты, образуемые при метаболизме пирувата, — имеет место в спиртовом брожении, осуществляемом дрожжами и некоторыми видами бактерий. Третья возможность связана с синтетическим процессом — усложнением молекулы пирувата, в результате которого создается более окисленная молекула акцептора, способная принять больше электронов с восстановленных переносчиков. Это происходит при присоединении к молекуле пирувата CO2, приводящем к формированию четырехуглеродного скелета. Процесс получил название гетеротрофной ассимиляции углекислоты.

Впервые гетеротрофная ассимиляция углекислоты была обнаружена в 1936 г. X. Вудом и К. Веркманом (Н. Wood, C. Werkman) при изучении сбраживания глицерина пропионовыми бактериями. Карбоксилирование пирувата, приводящее к образованию щавелевоуксусной кислоты, получило название реакции Вуда — Веркмана. У эубактерий обнаружены различные реакции карбоксилирования пирувата или его фосфорилированного производного. Показано, что реакции карбоксилирования имеют место у всех гетеротрофных прокариот, а также в клетках всех эукариотных организмов, включая высшие растения и животных. Кроме того, в больших масштабах в природе реакции связывания CO2 осуществляются автотрофными. организмами в процессе хемо- и фотосинтеза.

В пропионовокислом брожении мы имеем дело с реализацией третьей возможности превращения пирувата — его карбоксилированием, приводящим к возникновению нового акцептора водорода — ЩУК. Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом (рис. 54). Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика CO2. Донором CO2-группы служит метилмалонил-КоА. В результате реакции транскарбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоА:

Рассмотрим теперь дальнейшую судьбу каждого из двух продуктов реакции, а также вопрос о происхождении одного из субстратов реакции — метилмалонил-КоА. (Основным источником пировиноградной кислоты служит процесс гликолитического расщепления гексоз или окислительные превращения, если в качестве субстрата брожения используют, например, диоксиацетон или глицерин.) ЩУК в результате трех ферментативных этапов (аналогичных реакциям 6, 7, 8 цикла трикарбоновых кислот, см. рис. 92) превращается в янтарную кислоту:

Следующая реакция заключается в переносе КоА-группы с пропионил-КоА на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуется сукцинил-КоА и пропионовая кислота:

Образовавшаяся пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки. Сукцинил-КоА превращается в метилмалонил-КоА:

В состав кофермента метилмалонил-КоА-мутазы входит витамин B12. Перегруппировки типа, указанного в приведенном выше уравнении, характерны для реакций, катализируемых ферментами, содержащими витамин B12. В описанной выше реакции происходящие перемещения атомов в молекуле сводятся к двум типам: изменению углерод-углеродных связей и перераспределению водорода между углеродными атомами (рис. 55). Реакция, катализируемая мутазой, — ключевая в пропионовокислом брожении, так как в ней подготавливается субстрат, являющийся предшественником пропионовой кислоты.

Из схемы, представленной на рис. 54, можно видеть, что образование пропионовой кислоты из пировиноградной — результат взаимосвязанного функционирования двух циклов: цикла переноса одноуглеродного фрагмента и цикла переноса кофермента А.

Кофермент А, принимающий активное участие в пропионовокислом брожении, относится к группе мононуклеотидов. Он содержит аденин, Д-рибозу, пирофосфатную группу и пептидоподобное соединение, в состав которого входит пантотеновая кислота — еще один витамин группы В. Функция кофермента А заключается в переносе ацильных групп (RCO~). Ацильная форма КоА представляет собой тиоэфир. Тиоэфирная связь, образующаяся между карбоксильной группой кислоты и тиоловой группой КоА, является высокоэнергетической.

Итак, разобранный выше поток реакций приводит к синтезу пропионовой кислоты. Однако пропионовокислое брожение — более сложный процесс, поскольку наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и CO2. В схеме, изображенной на рис. 54, янтарная кислота образуется как промежуточное соединение на пути, ведущем к синтезу пропионата; но она может накапливаться в среде и как конечный продукт. К образованию сукцината, количество которого зависит от содержания CO2 в среде, ведет последовательность реакций, начинающаяся с карбоксилирования ФЕП (рис. 56), в которой остаток фосфорной кислоты ФЕП переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию пирофосфата:

ФЕП + CO2 + ФН ® ЩУК + пирофосфат.

Дальнейшие превращения ЩУК до янтарной кислоты аналогичны реакциям 2 — 4, изображенным на рис. 54.

Многие пропионовые бактерии сбраживают глюкозу так, что на каждую молекулу пирувата, окисленную до уксусной кислоты и CO2, приходятся 2 молекулы пирувата, восстановленные до пропионовой кислоты. Путь превращения пирувата, приводящий к образованию уксусной кислоты и CO2, представлен на рис. 56. На этом пути имеют место окислительно-восстановительные реакции, идущие с вовлечением новых молекул НАД+. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию с участием кофермента А:

Процесс катализируется пируватдегидрогеназным комплексом и практически необратим. В результате образуется ацетил-КоА, содержащий высокоэнергетическую тиоэфирную связь, ацетильная группа с которого переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию ацетилфосфата и регенерированию кофермента А:

В этой реакции энергия, заключенная в тиоэфирной связи, реализуется в виде высокоэнергетической фосфатной связи ацетилфосфата.

И наконец, ацетилфосфат донирует фосфатную группу на АДФ с образованием АТФ и уксусной кислоты:

Итак, на участке от пирувата до ацетата образуется 1 молекула НАД-H2 и 1 молекула АТФ. Энергетическое значение для пропионовых бактерий этого участка метаболического пути очевидно и не требует обсуждения.

Кроме основных продуктов в разных количествах в культуральной жидкости пропионовых бактерий обнаружены молочная, муравьиная, изовалериановая кислоты, этиловый и пропиловый спирты, уксусный и пропионовый альдегиды, ацетоин, диацетил. Состав конечных продуктов брожения зависит от культуры бактерий, состава среды и условий культивирования. Это касается как видов накапливаемых продуктов, так и количественных соотношений между ними.

Теоретически пропионовое брожение должно приводить к образованию 4 молекул АТФ при сбраживании 1,5 молекулы глюкозы. Однако было обнаружено, что выход энергии несколько выше. Источником дополнительных молекул АТФ, возможно, является этап восстановления фумаровой кислоты до янтарной, катализируемый фумаратредуктазой (см. рис. 54). Получены экспериментальные данные в пользу того, что восстановление фумарата до сукцината — процесс, в результате которого некоторые первично анаэробные эубактерии могут синтезировать АТФ по механизму фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов. Показано, что фумаратредуктаза связана с мембраной и образует комплекс с переносчиком электронов хиноном. В составе комплекса обнаружен цитохром b. Фумаратредуктазная система найдена у пропионовых бактерий. Этой системе придается большое значение в эволюции как, возможно, первому шагу на пути создания многокомпонентных электронтранспортных цепей у эубактерий (см. гл. 15).

Энергетическая эффективность пропионовокислого брожения связана также с выработкой пропионовыми бактериями новых метаболических способностей: реакций транскарбоксилирования и перегруппировки, участия в процессе КоА-производных. Образование дикарбоновой кислоты из пировиноградной с использованием механизма транскарбоксилирования вместо прямого карбоксилирования пирувата позволяет избежать дополнительных энергетических затрат на этом этапе брожения. Все это вместе взятое позволяет рассматривать пропионовокислое брожение как более совершенный из рассмотренных до сих пор способов получения энергии в анаэробных условиях.

Пропионовокислые бактерии

В эту группу, объединяемую в род Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид — P. freudenreichii.

Большинство пропионовокислых бактерий — аэротолерантные анаэробы, получающие энергию в процессе брожения, основным продуктом которого является пропионовая кислота. Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности. Внутри группы отношение к O2 различно. Некоторые виды могут расти в аэробных условиях.

Брожение не исчерпывает всех возможностей получения энергии этой группой эубактерий. Хотя гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения пировиноградной кислоты является основным путем разложения глюкозы, кроме этого пути в группе пропионовых бактерий обнаружен окислительный пентозофосфатный путь, реакции ЦТК, активное "флавиновое дыхание" и окислительное фосфорилирование, сопряженное с электрон-транспортной системой. Вклад каждого из этих путей в общий энергетический метаболизм зависит как от вида бактерий, так и от конкретных внешних условий. Эволюция пропионовых бактерий определенно шла по пути приспособления к аэробным условиям. У некоторых видов обнаружен "эффект Пастера": в присутствии кислорода воздуха происходит переключение с брожения на дыхание. Пропионовые бактерии могут синтезировать гемсодержащие белки. В их клетках обнаружены цитохромы.

Важную роль в аэробном метаболизме пропионовых бактерий играет "флавиновое дыхание", которому приписывают основную связь этих бактерий с молекулярным кислородом. В процессе "флавинового дыхания" происходит перенос двух электронов с флавопротеинов на O2, сопровождающийся образованием перекиси водорода, которая разлагается бактериальной каталазой и пероксидазой. Однако "флавиновое дыхание" не связано с получением клеткой энергии. Транспорт электронов в дыхательной цепи некоторых пропионовых бактерий сопровождается образованием АТФ, что может указывать на подключение к этому процессу цитохромов, однако эффективность окислительного фосфорилирования низка. Последнее, вероятно, объясняется несовершенством механизмов сопряжения. В то время как в аэробных условиях конечным акцептором электронов с НАД-H2 является O2, в анаэробных условиях им может быть нитрат, фумарат.