MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Прозоркина H. В., Рубашкина П. А. - Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

В бактериологических лабораториях используется такой вид стерилизации, как прокаливание над огнем. Этот способ применяют для обеззараживания бактериологических петель, шпателей, пипеток. Для прокаливания над огнем используют спиртовки или газовые горелки.

К физическим способам стерилизации относятся также УФ-лучи и рентгеновское излучение. Такую стерилизацию проводят в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдерживают высокой температуры.

Механическая стерилизация — проводится при помощи фильтров (керамических, стеклянных, асбестовых) и особенно мембранных ультрафильтров из коллоидных растворов нитроцеллюлозы. Такая стерилизация позволяет освобождать жидкости (биопрепараты, сыворотку крови, лекарства) от бактерий, грибов, простейших и вирусов, в зависимости от размеров пор фильтра. Для ускорения фильтрации создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.

В микробиологической практике часто используют асбестовые фильтры Зейтца, Шамберлана. Такие фильтры рас-читаны на одноразовое применение.

Химическая стерилизация — этот вид стерилизации применяется ограниченно. Чаще всего используют химические вещества для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов.

При химической стерилизации возможно использование двух токсичных газов: окиси этилена и формальдегида. Эти вещества в присутствии воды могут инактивировать ферменты, ДНК и РНК, что приводит бактериальные клетки к гибели. Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при 50—80°С в специальных камерах. Этот вид стерилизации опасен для окружающих, однако существуют объекты, которые могут быть повреждены при нагревании и по-

3* 67 этому их можно стерилизовать только газом. Например, оптические приборы, некоторые питательные среды.

Для проведения стерилизации тех или иных объектов необходимо строго соблюдать установленный режим стерилизации (например, для питательных сред он указан в рецепте приготовления).

При проведении стерилизации в автоклаве необходимо осуществлять контроль стерилизации.

Существует 3 вида контроля:

* химический — в автоклав при каждой загрузке кладут бензойную кислоту, мочевину, запаянные в ампулы, или индикаторы стерилизации ТВИ — 120°С — 1 атм, ТВИ - 132°С - 2 атм.

При достижении заданного режима стерилизации указанные вещества меняют свой цвет, а термовременные индикаторы темнеют; термический — 2 раза в месяц максимальным термометром во время стерилизации проводят замер температуры в контрольных точках, которая должна достичь заданных параметров;

* биологический — проводится 2 раза в год. В контрольных точках помещают пробирки со споровой культурой Bacillus stearothermophilies, погибающей при 120°С в течение 15 мин. После стерилизации пробирки помещают в термостат при t = 55 °С на 48 часов. При достижении заданного режима рост тесткульту-ры отсутствует: фиолетовой цвет среды в пробирках не меняется.

Для сохранения стерильности стерилизуемые предметы должны иметь упаковку, не допускающую микробного загрязнения.

§ 5. Бактериофаги

Бактериофаги — это вирусы, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, репродуктироваться в них и вызывать их лизис.

Фаги широко распространены в природе — в воде, почве, сточных водах, в кишечнике животных, человека, птиц, в раковых опухолях растений. Фаг был выделен из молока, овощей. Источником фагов патогенных микробов являются больные люди и животные, бактерионосители, реконвалес-центы. Выделяются с содержимым кишечника, мочой, его обнаруживали в мокроте, слюне, гное, носовом секрете. Особенно большое количество фагов выделяется в период выздоровления.

Фаг получают путем добавления в котлы с бульонными культурами специального производственного фага, который выдерживают сутки при 37°С, затем фильтруют. Проверяют на чистоту, стерильность, безвредность и активность (силу действия).

Структура и морфология фагов: большинство фагов состоит из головки, воротничка и хвостового отростка, заканчивающегося базальной пластинкой, к которой прикреплены фибриллы.

Содержание головки — это ДНК (иногда РНК). Хвостовой отросток имеет цилиндрический стержень, окруженный сократительным чехлом. В оболочку фаговой частицы и отросток входит белок, состоящий из полиаминов: спермин, путресцин, кислоторастворимый пептид.

Фаги более устойчивы во внешней среде, чем бактерии. Выдерживают давление до 6000 атм., устойчивы к действию радиации. До 13 лет не теряют своих литических свойств, находясь в запаянных ампулах.

Некоторые вещества, например, хлороформ и ферментативные яды (цианид, флорид), не оказывают влияния на фаги, но вызывают гибель бактерий.

Однако фаги быстро погибают при кипячении, действии кислот, УФ-лучей.

Фаги обладают строгой специфичностью, т. е. способны паразитировать только в определенном виде микроорганизмов: стрептококках, стафилококках и т. д. Фаги с более строгой специфичностью, которые паразитируют только на определенных представителях данного вида, называются типовыми. Фаги, которые лизируют микроорганизмы близких видов, например, видов, входящих в род возбудителей дизентерии (шигелл), называются поливалентными.

По механизму взаимодействия с клетками фаги подразделяются на вирулентные и умеренные.

Феномен бактериофагии, вызываемый вирулентными фагами, проходит в 5 фаз:

1) адсорбция — с помощью нитей хвостового отростка;

2) проникновение в клетку;

3) репродукция белка и нуклеиновой кислоты внутри клетки;

4) сборка и формирование зрелых фагов;

5) лизис клетки, выход фага из нее.

Умеренные фаги не лизируют все клетки, а с некоторыми вступают в симбиоз. Клетка выживает. Умеренный фаг превращается в профаг, который не обладает литическим действием.

Лизогенезация бактерий сопровождается изменением их морфологических, культуральных, ферментативных, антигенных и биологических свойств. Так, например, нетокси-генные штаммы коринебактерий дифтерии в результате ли-зогенизации превращаются в токсигенные. Практическое использование фагов: * назначают с профилактической и лечебной целью при дизентерии, брюшном тифе, паратифах, холере, чуме, стафилококковой инфекции; в диагностике инфекционных заболеваний; метод фаготипирования дает возможность устанавливать вид бактерий и тем самым выявлять источники инфекции.

§ 6. Генетика бактерий

Генетика (от греч. genos — рождение) — это наука, изучающая наследственность и изменчивость. Микроорганизмы обладают способностью изменять свои основные признаки:

морфологические (строение); культуральные (рост на питательных средах); биохимические или ферментативные признаки (добавление определенных веществ в питательную среду может вызвать активацию фермента, который до этого находится в латентном состоянии); биологические свойства — может меняться степень па-тогенности, на этом основаны способы приготовления живых вакцин.

Например, при 12—14-дневном культивировании возбудителя сибирской язвы при t° — 42—43°С микробы потеряли способность вызывать заболевание у животных, но сохранили свои иммуногенные свойства.

БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) снизила болезнетвор-ность бычьего вида микобактерий туберкулеза путем длительных пассажей на картофельной среде с желчью и глицерином при t° 38°C. Пересевы через каждые 14 дней получили ослабленный штамм микобактерий туберкулеза, который назван «вакциной» БЦЖ, используемой для профилактики туберкулеза.

Наследственность — это способность организмов сохранять определенные признаки на протяжении многих поколений.

Изменчивость — это приобретение признаков под влиянием различных факторов, отличающих их от предыдущих поколений.

Генетическая информация в клетках бактерий заключена в ДНК (у некоторых вирусов РНК). Молекула ДНК состоит из двух нитей, каждая из которых спирально закручена относительно другой. При делении клетки спираль удваивается. И вновь образуется двунитчатая молекула ДНК. В состав молекулы ДНК входят 4 азотистых основания — одекаин, гуанин, цитозин, тимин. Порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их наследственную информацию, закодированную в ДНК.

Формы проявления изменчивости

Ненаследственная, фенотипическая изменчивость, или модификация, микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные условия ее существования. Эта адаптивная реакция на внешние раздражители не сопровождается изменением генотипа и поэтому не передается по наследству. Могут измениться морфология (удлиняется), культуральные свойства (стафилококки без пигмента при недостатке кислорода) биохимические или ферментативные свойства, вырабатываются адаптивные ферменты Е. coli, фермент лактаза на среде — с лактозой.

2. Наследуемая генетическая изменчивость возникает в результате мутаций и генетических рекомбинаций. Изменчивость микроорганизмов

Фенотипическая изменчивость (ненаследуемая модификация)

Генотипическая изменчивость наследуемая

Мутации (от лат. mutatio — изменять) — это передаваемые по наследству структурные изменения генов. При мутациях изменяются участки геномов (т. е. наследственного аппарата).

Бактериальные мутации могут быть спонтанными (самопроизвольными) и индуцированными (направленными), т. е. появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (хим. веществами, температурой, излучением и т.д.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться:

* изменение морфологических свойств; изменение культуральных свойств; возникновение у микроорганизмов устойчивости к лекарственным препаратам;

* ослабление болезнетворных свойств и др.

К генетическим рекомбинациям относятся рекомбинации генов, которые происходят вследствие трансформации, от донора трансдукции и конъюгации.

Трансформация — передача генетического материала реципиенту при помощи изолированной ДНК другой клетки. Клетки, способные воспринимать ДНК другой клетки, называются компетентными.

Состояние компетентности часто совпадает с логарифмической фазой роста. Для трансформации необходимо создавать особые условия, например, добавляя неорганические фосфаты, повышается частота трансформации.

Трансдукция — это перенос наследственного материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту, который осуществляет фаг. Например, с помощью фага можно воспроизвести трансдукцию жгутиков, ферментативные свойства, ре-зистентность к антибиотикам, токсигенность и другие признаки.

Конъюгация бактерий — передача генетического материала от одной клетки другой путем непосредственного контакта. Причем происходит односторонний перенос генетического материала — от донора реципиенту. Необходимым условием для конъюгации является наличие у донора специфического фактора плодовитости F. У граммотрицательных бактерий обнаружены половые F-волоски, через них происходит перенос генетического материала. Клетки, играющие роль донора, обозначают F+, а реципиенты — F.

F-фактор находится в цитоплазме клеток, причем он не один. При конъюгации происходит перенос только ДНК без РНК и белка.

Практическое значение изменчивости: с помощью генетических методов получены специальные культуры дрожжей и других микробов, используемые в технологии изготовления пищевых продуктов, производстве анатоксинов, вакцин, антибиотиков, витаминов;

* большое научное и практическое значение имеет генная инженерия, методы которой позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ, которые получить химическим путем очень трудно, — инсулин, интерферон и др.;

* при использовании мутагенных факторов (УФ-лучей, рентгеновские лучи, у-лучи, диэтилсульфат и др.) были получены мутанты — продуценты антибиотиков, которые в 100—1000 раз активнее исходных.

§ 7. Практическая часть

Подготовка к стерилизации лабораторной посуды

1. Перед стерилизацией лабораторную посуду тщательно моют и сушат.

2. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок.

3. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1— 5 штук или в пеналах.

4. Пастеровские пипетки по 3—5—10—15 штук заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180°С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут.

б) в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20—30 минут.

Стерилизация металлических инструментов

Ножницы, скальпели, пинцеты и пр. стерилизуют в 2% содовом растворе (сода предупреждает появление ржавчины и потерю остроты). Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в воду рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий

Перчатки, шланги, трубки и другие, загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе соды или текучим паром 30 минут; при загрязнении спороносной патогенной микрофлорой — в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.

Приготовление дезрастворов группы хлора

1. Хлорная известь обладает высоким бактериальным действием. Ее используют в микробиологической практике в виде порошка, 10—20% хлорно-известкового молока и 0,2—10% осветленного раствора.

2. Схема приготовления хлорно-известкового молока.

Концентрация хлорно-нзвсстко-вого молока (в %)

Количество хлорной извести в граммах на 10 л воды при содержании в ней активного хлора (в %)

В таблице показана взаимосвязь между содержанием активного хлора в хлорной извести и ее количеством, необходимым для приготовления 10 л хлорно-известкового молока 10—20% концентрации.

3. Хлорамин — содержит 25—26,5% активного хлора.

В микробиологических лабораториях пользуются 0,2— 10% растворами хлорамина.

Концентрация раствора (в%)

Количество хлорамина в 1 г на:

Приготовление маточного раствора хлорной извести

1. Взять емкость (стеклянные бутыли темного стекла с притертой пробкой, эмалированная или стеклянная посуда) и поместить в нее 1 кг сухой хлорной извести, после чего, продолжая помешивать, добавить постепенно небольшое количество воды до получения кашицеобразной массы. И затем, перемешивая, добавить воду до объема 10 литров, т. е. для приготовления 10% р-ра хлорной извести необходимо взять: 1 кг сухой хлорной извести + 9 литров воды = = 10 литрам раствора.

2. Свежеприготовленные растворы оставляют на 24 часа в прохладном темном помещении в закрытой посуде. Через 24 часа осторожно, не взбалтывая осадка, сливают осветленный раствор в другую емкость (стеклянные емкости темного цвета, эмалированная или пластмассовая посуда) для хранения до 10 дней.

3. При приготовлении маточного раствора на емкости (на этикетке, которая крепится на ней) указывается дата приготовления, концентрация раствора, должность, фамилия лица, приготовившего раствор.

Внимание! Использование оцинкованной посуды запрещено. Дезрастворы группы фенола

1. Карболовая кислота. Жидкая карболовая кислота содержит 90% кристаллического фенола и 10% воды. В микробиологических лабораториях используют 3—5 % растворы карболовой кислоты.

Схема приготовления растворов карболовой кислоты

2. Хромовая смесь. Пропись приготовления:

В колбу наливают 150 мл концентрированной серной кислоты, туда же всыпают 25 г двухромовокислого калия. Полученную смесь оставляют стоять до растворения. Через сутки раствор темно-оранжевого цвета может быть применен для мытья посуды. Перед употреблением смесь надо подогреть до 45—50°С. Если цвет смеси меняется на темно-зеленый, это говорит о ее непригодности.

Выделение бактериофага из патологического материала

Исследуемую жидкость фильтруют от микробов.

Твердый исследуемый материал (почва, пищевые продукты, оформленные испражнения) измельчают в ступке, эмульгируют, фильтруют. Наличие фага в полученном фильтрате определяют в жидких питательных средах или на плотных средах по методу Отто или Грациа.

Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах по методу Отто

1,5% МПА разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие колоний бактериофага). После застудневания МПА засевают 16—18-часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста посев растирают шпателем. Спустя 5—10 мин после посева на подсушенную поверхность каплями наносят исследуемый фильтрат. Чашки ставят в термостат на 18—24 часа при температуре 37°С.

Нет результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом месте мелких стерильных пятен-колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

Техника фаготшшрования микробов по методу Креджи и Иенсена

В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса определяет типовую принадлежность бактерий. Для фаготипирования бактерий применяют 1,5% МПА с 5% глицерина. Пророщенную бульонную культуру каплями наносят на поверхность питательной среды. Капли не должны растекаться. Они должны впитаться в течение 3—10 мин.

Затем на поверхность каждой капли наносят по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага (для контроля роста культуры). Чашки помещают в термостат при температуре 37°С: через 6—8 часов производят учет результатов фаготипирования.

Наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов указывает на принадлежность культуры к данному фаготипу.

Приложение 7.4 (справочное)

СП 1.2.731—99

Средства и методы дезинфекции, используемые при работе с микроорганизмами III—IV групп патогенности

I. Бактерии, не образующие спор

1. Хлорамин Б или ХБ (содержание активного хлора — АХ не менее 26%):

0,5%, 1%, 2%, 3%-е (по препарату) растворы.

2. Хлорная известь (содержание АХ не менее 25%):

сухое вещество;

0,5%, 1%, 2%-е (по препарату) осветленные растворы;

10%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы;

20%-и (по препарату) хлорно-известковое молоко.

3. Известь белильная термостойкая (содержание АХ не менее 25%):

сухое вещество;

0,5%, 1%, 2%-е (по препарату) осветленные растворы;

10%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы.

4. Нейтральный гипохлорит кальция — НГК (содержание АХ не менее 52% для марки А и не менее 24% для марки Б):

сухое вещество;

0,15%-й (по АХ) раствор;

0,25%, 0,5%, 1 %-е (по АХ) осветленные растворы;

5%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы.

5. Гипохлорит кальция технический — ГКТ (содержание АХ не менее 35%):

сухое вещество;

1%, 1,5%-е (по препарату) осветленные растворы;

5%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы.

6. Двутретьосновная соль гипохлорита кальция — ДТС ГК (содержание АХ не менее 47%):

сухое вещество;

0,25 %, 0,5 %, 1 %-е (по препарату) осветленные растворы;

5%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы.

7. Двуосновная соль гипохлорита кальция — ДСГК (содержание АХ не менее 30%):

сухое вещество;

1 %-й (по препарату) осветленный раствор;

5%-е (по препарату) осветленные и неосветленные растворы.

8. Гипохлорит натрия (содержание АХ не менее 14%):

1%-й (по АХ) раствор.

9. Гипохлорит натрия, получаемый методом электролиза поваренной соли на установках, разрешенных к производству и применению 0,125%, 0,25%-е (по АХ) растворы.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru