Прозоркина H. В., Рубашкина П. А. - Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии

Мочу центрифугируют, засевают осадок в 5 мл магниевой среды обычной концентрации или 10 мл мочи на 10 мл среды двойной концентрации. Через 18—20 часов инкубации при 37°С делают высев петлей на висмут-сульфит агар, инкубируют при 37°С 48 часов. При наличии подозрительного роста идентификацию проводят по общепринятой методике.

Промывные воды желудка после нейтрализации (1 мл 10% соды на 10 мл пробы) засевают по 0,1 мл на среду Эндо (Левина), Плоскирева, ЖСА, кровяной агар.

Дальнейшее исследование проводят в зависимости от характера роста по общепринятой методике.

Критерии диагностики

Высокая обсемененность пищевых продуктов, вызвавших отравление, 105 и более КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 г, обнаружение идентичных культур в клиническом материале от пострадавших, нарастание титра антител при исследовании в динамике парных сывороток подтверждают диагноз пищевой токсикоинфекции.

Объекты санитарно-бактериологического обследования:

а) готовые блюда, кулинарные изделия, скоропортящиеся пищевые продукты в предприятиях общественного питания и торговли; б) в отдельных случаях сырье и полуфабрикаты (по ходу технологического процесса — по эпидпоказаниям, при высокой бактериальной обсемененности готовых продуктов, блюд и др.).

в) оборудование, инвентарь, посуда и др. с целью эффективности санитарной обработки; г) смывы с рук, санитарной одежды, личных полотенец (с целью проверки соблюдения правил личной гигиены персоналом); д) вода центрального водоснабжения и особенно местных источников водоснабжения (места водозабора и краны).

Техника отбора проб

Для отбора проб продуктов и блюд в лаборатории заготавливаются стерильные банки, закрытые двумя слоями бумаги и обвязанные бечевкой, стерильные ложки, стерильные пинцеты и ножи, завернутые в бумагу.

Пробы продуктов рекомендуется отбирать вдвоем с привлечением в качестве помощника представителя обследуемого учреждения. Помощник в одной руке держит банку, другой — по мере необходимости открывает крышку. В это время лицо, отбирающее пробу, развертывает требующуюся ему ложку или пинцет, берет материал и переносит в банку. При необходимости отбора пробы от большого куска отрезают часть его с помощью стерильного ножа и пинцета, не менее 200 г. Жидкие блюда отбирают после тщательного перемешивания, плотные — из разных мест в глубине куска.

§ 8. Санитарно-микробиопогическое

исследование молока и молочных продуктов.

Отбор продуктов (ГОСТ 9225—84)

Объединенную пробу молока объемом 500 см3 составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны. От данной пробы после тщательного перемешивания отбирают 50—60 см3 продукта в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой.

От продукции, попавшей в выборку, отбирают для анализа 15—20 г (включая и поверхностный слой) творога, творожных изделий, масла в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой.

При отборе сыра стерильным шпателем или ножом прижигают его поверхность. Стерильный щуп вводят наклонно в середину головки на 34 его длины. Из столбика сыра на щупе отбирают стерильным шпателем 15—20 г сыра и помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой или стерильную чашку Петри с крышкой.

Пробу, отправляемую в лабораторию, снабжают этикеткой, на которой указывают:

номер пробы; наименование предприятия-изготовителя;

* наименование и сорт продукта;

* номер и объем партии;

* дату и час выработки продукта;

* дату и час отбора проб;

* должность и подпись лица, отобравшего пробу;

* объем необходимых анализов; обозначение нормативно-технической документации, по которой вырабатывался продукт.

Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 часа с момента отбора проб.

Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6°С, не допуская подмораживания, а для мороженого — не выше минус 2°С.

Определение общего микробного числа и коли-титра в молоке

Перед посевом готовят десятикратные разведения молока в стерильном растворе хлористого натрия. Для этого стерильной пипеткой отбирают 10 см3 молока и вносят в 90 см3 стерильного раствора хлористого натрия, получают разведение 1 : 10. Далее из него готовят последующие разведения 1 : 100, 1 : 1000 и т. д.

Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10—15 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40—45° С питательной средой для определения количества мезофильных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

После застывания агара чашки Петри перевертывают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой 30 + 1 °С на 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке. При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 13 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 см3 продукта (х) в единицах вычисляют по формуле х = n- 10"1, где n — количество колоний, подсчитанных на чашке Петри; m — число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Допустимое количество микробов в 1 мл молока пастеризованного бутылочного 75 000, во флягах и цистернах 150 000.

Метод определения коли-титра БГКП

Под коли-титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженные в мл (вода, молоко, жидкие пищевые продукты) или в г (плотные пищевые продукты), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек.

Метод основан на способности БГКП (бесспоровые, грам-отрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки, в основном, являющиеся представителями родов эше-рихий, цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серация) сбраживать в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24 часов.

Проведение анализа

В среду Кесслер производят посев из разведений молока от 0,1 до 0,00001. По 1 см3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслер. Пробирки с посевами помещают в термостат при 37°С на 18—24 часа.

На вторые сутки просматривают пробирки и при отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП.

При наличии газообразования в наименьшем из засеиваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем.

Учет результатов

Для установления коли-титра применяют стандартные таблицы.

§ 9. Саннтарно-мнкробиопогическое исследование мяса и мясных продуктов

Сырое мясо исследуется по требованию ветеринарной или санитарной службы на наличие различной патогенной микрофлоры: сальмонелл, возбудителей сибирской язвы и т. д. Методика исследования мяса на патогенную микрофлору изложена в ГОСТе 21237—75.

Полуфабрикаты из рубленого мяса исследуются также только на наличие патогенной флоры (ГОСТ 4288—76).

В готовых кулинарных изделиях, колбасах, студнях и других мясных продуктах, подвергнутых термической обработке, кроме того, определяются:

общая бактериальная обсемененность; обсемененность продукта микробами группы кишечной палочки и протея.

Эти показатели отражают как качество обработки продукта, так и санитарные условия его хранения.

Методика исследования кулинарных изделий из рубленого мяса (котлеты, битки и т. д.) изложена в ГОСТе 4288— 76.

Для анализа отдельно отбирают по 5 г наружной и внутренней части изделия и из каждой готовой 10% суспензию (разведение 1 : 10), для чего к 5 г, помещенным в стерильную ступку, постепенно приливают 45 мл стерильного физраствора.

Для определения общей обсемененности производят дополнительное разведение 1 : 100 (10% взвесь разводят в 10 раз) и 1 мл этого разведения заливают МПА в стерильных чашках Петри. Посевы инкубируют 48 г при 37°С. Расчет производят как обычно на 1 г исследуемого продукта.

ГОСТ 4288—76 предусматривает лишь определение наличия микробов группы кишечной палочки в 0,5 г изделия.

Порядок анализа: 5 мл 10% взвеси продукта засевают в 5 мл питательной среды и инкубируют посевы 24 часа при температуре 37°С. В случае роста кишечных палочек на среде Хейфеца, происходит ферментация манита, среда приобретает желтый цвет. Для окончательного заключения о наличии бактерий группы кишечной палочки в изделии делают высев с жидких сред на чашки со средой Эндо. При наличии на чашках после 24-часовой инкубации при 37°С подозрительных колоний изготовляют мазки и окрашивают их по Граму.

Наличие в посевах Гр~ неспоровых бактерий, образующих характерные для группы кишечных палочек колонии, указывает на загрязненность изделия кишечными палочками, имеющими санитарно-показательное значение.

Методы бактериологического исследования колбасных изделий и продуктов из мяса изложены в ГОСТе 9958—74.

Пробы для баканализа этих продуктов берут следующим образом:

а) колбасные изделия в оболочке и копчености помещают на металлическую тарелку, тщательно протирают по поверхности тампоном, смоченным спиртом и обжигают. Затем батоны разрезают продольно (стерильным флам-бированным) ножом или скальпелем на 2 половинки, не рассекая противоположную сторону батона. Пробу снимают путем соскоба или среза фарша с обеих половинок всей поверхности разрезанного батона; б) из продуктов на костях стерильным инструментом вырезают кусочки, взятые с различных участков обожженного образца на глубине 2—3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости; в) мясные хлеба, студень и другие изделия без оболочки подвергаются исследованию, взяв пробы с поверхности и из глубины продуктов.

Для этого пробу из глубины продукта помещают в тазик, смачивают спиртом и обжигают. Обожженную поверхность соскабливают стерильным ножом или срезают и затем вырезают в нескольких местах 2—3 кусочка. Отобранную пробу взвешивают. 20 г помешают в ступку, и добавляя стерильный физраствор, готовят разведение 1:5. Для более тщательного растирания добавляют небольшое количество стерильного песка или стерильного битого стекла.

Определение общей обсемененности по ГОСТу следует производить путем посева 0,5 мл в разведении 1 : 5 и 1 : 50 в расплавленный и остуженный, как обычно, агар и чашки с посевами в термостат на 48 часов при 37°С.

Подсчитанное число колоний умножают на степень разведения продукта (на 10 или 100), т. е. определяют количество микробов в 1 г продукта.

В колбасах предусмотрено определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта, для чего 5 мл анализируемой взвеси (разведение 1 : 5) вносят в пробирки, содержащие по 10 мл среды Кесслера или Хейфеца двойной концентрации — 43°С — 20 часов. Дальнейшее ведение исследования аналогично исследованию кулинарных продуктов из рубленого мяса. По ГОСТу, если в 1,0 г продукта не обнаружены кишечные палочки, его бактериологическое состояние удовлетворительное.

§ 10. Исследование консервов

Бактериологическое исследование готовых консервов проводится по ГОСТ 30425—97. Консервы. Метод определения промышленной стерильности, ГОСТ 10444.15—94. Продукты пищевые. Методы определения количества ме-зофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Анализ готовой продукции проводится лабораториями центров Госсанэпиднадзора, как правило, с целью установления промышленной стерильности консервов.

По эпидемиологическим показаниям консервы исследуют для выявления патогенной и токсигенной микрофлоры.

Кроме того, консервы исследуют для выяснения причин возникновения порчи (выявление возбудителей порчи).

Консервированные продукты, удовлетворяющие требованиям промышленной стерильности, не должны представлять опасность для здоровья потребителя и не должны портиться во время хранения.

Готовые консервы не должны содержать патогенных микробов и иметь признаков порчи, обусловленных жизнедеятельностью микробов.

Отбор проб для исследования (ГОСТ 26668—85)

Проводят внешний осмотр банок. Отмечают наличие ржавчины, деформации, подтеков. В журнале записывают маркировку жестяных банок, со стекляных банок отклеивают этикетку. Тщательно моют банки теплой водой с мылом, насухо обтирают.

Проверяют герметичность банок. Для этого в эксикатор наливают свежеприготовленную в течение 15 с и охлажденную до 40—45°С воду, опускают на дно эксикатора банки и наблюдают за пузырьками воздуха. Негерметичной считается банка, у которой из одного и того же места выходит струйка воздуха или периодически несколько пузырьков.

Негерметичные банки бактериологическому исследованию не подлежат. Герметически упакованные, бездефектные по внешнему виду консервы подвергаются термостатной выдержке до 10 дней при 30—55°С в зависимости от консервов для проверки на бомбаж. О наличии бомбажа судят по вздутию дна или крышки банки.

Вскрытие банки и посев консервов производят при строгом соблюдении правил асептики (в боксах).

Исследование консервов на аэробы и анаэробы

Проведение анализа

В подозрительных консервах при наличии кольца на границе продукта с тарой или осадка на дне банки навески отбирают без предварительного перемешивания продукта для того, чтобы в навеску попала часть осадка или кольца.

Масса или объем навески продукта должны составлять для высева в две пробирки с жидкой питательной средой — 2 г или 2 см3 при выявлении аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных микроорганизмов.

После отбора навесок продукта консервы сохраняют до окончания анализа и оформления результатов при температуре 4 + 2°С в условиях, исключающих их повторное заражение микроорганизмами. Если в посевах будут выявлены жизнеспособные микроорганизмы, то при необходимости отбирают дополнительные навески продукта для высева в питательные среды с целью количественного подсчета обнаруженных микроорганизмов.

Для выявления жизнеспособных мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (ГОСТ 10444.3—85) в каждую из двух пробирок, содержащих по 5—6 см3 жидкой питательной среды (мясо — пептонный бульон), вносят по 1 г или 1 см3 консервированного продукта. . Сразу после посева на поверхность жидкой питательной среды наслаивают вазелиновое масло или парафиновую смесь слоем около 2 см.

Посевы термостатируют при температуре 30 ± 1°С не менее 5 суток с ежедневным наблюдением за появлением признаков развития микроорганизмов: помутнение среды, образование пленки, газа, осадка.

По мере необходимости из посевов отбирают культураль-ную жидкость для проведения исследований.

Принадлежность к термофильным аэробным и факультативно-анаэробным микроорганизмам устанавливают по изменению цвета среды, если она содержит индикатор-бромкрезоловый пурпурный, морфологии клеток, наличию спор, отношению к окраске по Граму, каталазной активности.

Схема проведения анализа консервов на промышленную стерильность (ГОСТ 30425—97)

Осмотр, регистрация, санитарная обработка

Проверка герметичности

* Термостатирование консервов

Определение внешнего вида консервов после термостатирования

Высев продукта в питательные среды,

Термостатирование посевов

Определение рН продукта

Микроскопиро-вание продукта

Фиксирование признаков роста микроорганизмов

Проба на каталазу \

Микроскопирование посевов, определение спорообразующей способности микроорганизмов

Определение группы, семейства, рода или вида микроорганизмов, отсутствие микроорганизмов, опасных для здоровья потребителя.

Оценка промышленной стерильности консервов

§ 11. Саннтарно-бактериологический контроль методом исследования смывов

Отбор проб и доставка в лабораторию

В практике текущего санитарного надзора за объектами общественного питания, торговой сети, пищеблоками детских дошкольных и подростковых учреждений, а также буфетами — раздаточными лечебно-профилактических учреждений широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность объективно оценить санитарное содержание обследуемых учреждений.

При проведении санитарно-бактериологических исследований смывов в основном ограничиваются выявлением бактерий группы кишечной палочки, обнаружение их расценивается как одно из подтверждений нарушения санитарного режима.

При выявлении вторичного массивного обсеменения готового продукта со значительным превышением в нем общего количества микробов, в смывах также необходимо определять общую бактериальную обсемененность и наличие бактерий рода Proteus и St. aureus.

При взятии смывов с оборудования, инвентаря, посуды, столовых приборов записывается: номер образца по порядку, место взятия смыва, в каком техническом и санитарном состоянии находилось оборудование (инвентарь, посуда и т. д.), с которого взят смыв, время забора.

При взятии смывов с рук записывается: номер по порядку, фамилия, имя и отчество сотрудника, выполняемая работа, время забора.

Доставка проб должна производиться в термоконтейнерах.

Время доставки проб продуктов и смывов в лаборатории для осуществления исследования не должно превышать двух часов, так как затягивание этого срока отражается на достоверности результатов анализа.

Техника взятия смывов

Взятие смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жидкости.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой.

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 см2, для ограничения поверхностей используют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки. Трафарет имеет площадь 25 см2, чтобы взять смывы с площади в 100 см2 его накладывают 4 раза в разных местах поверхности контролируемого объекта.

При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных объекта— три тарелки, три ложки и т. п. У столовых приборов протирают их рабочую часть.

При исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз.

При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства.

При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2 — нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спецовки. С различных мест полотенца берут 4 площадки по 25 см2.

Методика исследования смывов. Объем исследования

На предприятиях общественного питания исследование смывов проводят на присутствие бактерий группы кишечных палочек.

Исследование на наличие золотистого стафилококка и протея, определение общей бактериальной обсемененности производится по показаниям.