Бочкарев Е. Г., Денисова Т. С. и др. - Генодиагностика во фтизиатрии

Приведенные выше данные многочисленных клинико-лабораторных исследований свидетельствуют об успешном внедрении метода полимеразной цепной реакции в практику противотуберкулезной службы. В настоящее время основным является определение показаний к применению ПЦР во фтизиатрии, ее диагностической значимости (в сравнении с микроскопическими и культуральными методами) и клиническая интерпретация получаемых с ее помощью результатов.

Возможности генодиагностики в идентификации резистентности микобактерий туберкулезного комплекса к противотуберкулезным химиопрепаратам

Возрастающее число мультирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis представляет собой серьезную проблему для современного здравоохранения. Лечение пациентов, инфицированных мультирезистентными штаммами, требует применения более токсичных и дорогостоящих химиопрепаратов, длительной госпитализации и, тем не менее, часто остается неэффективным, обуславливая высокий удельный вес инвалидизации и смертности.

Основным в решении этой проблемы является своевременная детекция мультирезистентных штаммов на ранних стадиях заболевания, которая позволит контролировать дальнейшее распространение конкретного выявленного штамма и подобрать оптимальную схему химиотерапии. Тем не менее, определение спектра лекарственной резистентности классическими методами на селекционных средах занимает от 3-х недель до 3-х месяцев, что делает полученный результат ретроспективным.

Альтернативным и более перспективным вариантом решения этой проблемы является использование генотипических методов анализа, основанных на выявлении точечных мутаций или других генетических детерминант, обеспечивающих резистентность к антибиотикам. Этот подход стал возможным благодаря определенному успеху в исследовании молекулярных основ резистентности Mycobacterium tuberculosis к таким противотуберкулезным препаратам, как рифампицин [52, 53], изониазид [24, 48, 57], фторхинолоны [50], стрептомицин [36] и канамицин [49]. Его отличительной чертой является небольшой срок выполнения анализа, составляющий 2-3 дня.

Рифампицин является одним из основных туберкулостатиков, что обуславливает высокий удельный вес резистентных к нему штаммов. Актуальность выявления резистентности к рифампицину обусловлена тем, что до 80 - 90% рифампицин-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивы и к изониазиду, что позволяет считать рифампицин-резистентные штаммы своеобразным косвенным "маркером" мультирезистентности [30, 36].

Около 95% резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis содержат точечные мутации, делеции или вставки в гене rpoB, кодирующем b - субъединицу РНК-полимеразы. Современные методы генодиагностики резистентности к рифампицину основаны на детекции мутаций, большая часть которых компактно локализована в высоко консервативной области rpoB гена [52].

Следует отметить, что эффективность такого подхода для детекции резистентных штаммов во многом зависит от того, насколько полно исследованы и охарактеризованы ассоциированные с резистентностью мутации. Считается, что тип и частота встречаемости определенных мутаций в rpoB гене достаточно консервативны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах [52, 56]. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций [29, 37, 46, 51]. К сожалению, штаммы, выявляемые на территории Российской Федерации и стран СНГ, в этом отношении остаются пока малоисследованными.

В 1997-99 г.г. в ЦНИИ туберкулеза РАМН, НИИ фтизиопульмонологии ММА им.И.М.Сеченова, Московском НПЦ борьбы с туберкулезом и НИИ физико-химической медицины МЗ РФ проводили детекцию и характеризовали мутации, обуславливающие резистентность к рифампицину в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких граждан Российской Федерации.

В качестве материала для исследования использовали клинические штаммы Mycobacterium tuberculosis, выделенные культуральным методом из мокроты больных с подтвержденным диагнозом туберкулеза легких. Всего было проанализировано 100 клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Из них 48 было представлено чувствительными и 52 резистентными к рифампицину и/или мультирезистентными штаммами.

Все исследуемые штаммы были предварительно тестированы на чувствительность к основным противотуберкулезным препаратам методом разведения на среде Левенштейна-Йенсена (метод абсолютных концентраций) [28]. В соответствии с критериями чувствительности на агаризованных питательных средах резистентными считались штаммы Mycobacterium tuberculosis, растущие при следующих или больших концентрациях антибиотиков:

Рифампицин 40 мкг/мл

Изониазид 1 мкг/мл

Этамбутол 8 мкг/мл

Стрептомицин 10 мкг/мл

Пиразинамид 100 мкг/мл

Канамицин 45 мкг/мл

ДНК из клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, выделяли в ходе обработки с гуанидинтиоцианатом по методу Р.Бума и соавт. [26], а затем нуклеотидную последовательность ПЦР фрагментов определяли по модифицированному методу Сэнгера с использованием набора для термоциклического секвенирования fmol DNA Sequencing System ("Promega").

Показано, что приблизительно в 95% случаев мутации, обуславливающие резистентность Mycobacterium tuberculosis к рифампицину локализованы, в высоко консервативной области rpoB гена с 511 по 533 кодон [37, 52, 56]. В ходе прямого секвенирования была проанализирована нуклеотидная последовательность rpoB гена с 498 по 540 кодон во всех клинических изолятах. Для удобства сравнения была использована предложенная Теленти [52] нумерация кодонов, основанная на гомологичных позициях кодонов в rpoB гене E.coli.

В 51 из 52 (98%) фенотипически резистентных к рифампицину штаммах были выявлены специфические мутации, охарактеризованные ранее, как ответственные за развитие резистентности. В 48 фенотипически чувствительных штаммах и одном резистентном мутаций в исследуемой области rpoB гена обнаружено не было. Всего в исследованной нами выборке было обнаружено 12 типов мутаций, затрагивающих 6 кодонов rpoB гена, из которых 10 - единичные нуклеотидные замены, одна вставка и одна двойная мутация, сочетающая единичную нуклеотидную замену с делецией целого кодона.

Таблица 14. Мутации, обнаруженные в rpoB гене устойчивых к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.

(.....)

Как следует из результатов секвенирования, доминирующими в исследуемой выборке оказались мутации, затрагивающие 531, 526 и 516 кодоны rpoB гена. При этом количественное распределение мутаций в 531 (46%) и 526 (23%) кодонах оказалось близко к среднестатистическим значениям в 42%-50% и 27%-35%, соответственно, полученным в двух масштабных исследованиях, проведенных в 9-ти и 11-ти странах [52, 56]. В то же время, число мутаций, приходящихся на 516 кодон оказалось почти в 2,5 раза большим при сравнении с теми же данными [52, 56]. Необычная двойная мутация, сочетающая замену в 514 кодоне F на L и делецию метионина в позиции 515, была обнаружена в одном из проанализированных нами штаммов. Так же обнаруженные в единичном случае мутация в 533 кодоне и вставка фенилаланина между 513 и 514 кодоном были охарактеризованы ранее и встречаются довольно редко (2%) [37].

В единственном из 52 фенотипически резистентных штаммов в области с 511 по 533 кодон rpoB гена не было обнаружено никаких генетических изменений. Рифампицин-резистентные штаммы Mycobacterium tuberculosis, не имеющие мутаций в указанном районе, встречаются в среднем с частотой 5% от общего числа резистентных [37]. Вероятно, что мутации в таких штаммах затрагивают другие области rpoB гена. В частности, недавно были охарактеризованы мутации, локализованные в 381, 481, 505, 508 и 509 кодонах [41, 42, 51]. В то же время, нельзя исключать и наличие других, неисследованных механизмов резистентности.

В целом, анализ rpoB гена в исследованной нами выборке клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis показал стандартное распределение известных мутаций, за исключением относительно высокого удельного веса мутаций в 516 кодоне и не охарактеризованной ранее делеции. Отсутствие выраженного географического полиморфизма в распределении мутаций свидетельствует о возможности применения для анализа таких штаммов генотипических методов, рассчитанных на детекцию стандартного спектра мутаций.

Одним из основных критериев при выборе метода анализа следует считать его информативность. Случаи обнаружения нейтральных мутаций в классической области между 511 и 533 кодоном [51] свидетельствуют о необходимости не только констатации наличия мутации в исследуемом гене, но и идентификации ее типа и точного положения. Кроме того, уровень резистентности в ряде случаев в значительной степени зависит от положения и типа мутации. В частности, большинство мутаций в 531 и 526 кодоне приводит к высокому уровню резистентности с минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) превышающей 40 мкг/мл, тогда как уровень резистентности, обуславливаемый мутациями в кодоне 516, может быть ззначительно ниже [25, 44].

Кроме секвенирования, для детекции мутаций в rpoB гене наиболее часто применяют методы конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) [52], гибридизации с линейными зондами (LiPA) [31, 33] и РНК/РНК гетеродуплексного анализа (RNA/RNA mismatch assay) [42]. Два последних в настоящее время коммерчески реализованы в виде наборов INNO-LiPA Rif.TB ("Innogenetics") и MisMatch Detect II ("Ambion"), успешно применяющихся для детекции стандартных мутаций как при работе с микобактериальной культурой, так и непосредственно с клиническими образцами [55]. Тем не менее, за исключением четырех основных мутаций, точно идентифицируемых набором LiPA Rif.TB, положение и тип остальных замен при помощи перечисленных методов можно определить достаточно условно. В этом отношении прямое секвенирование rpoB гена выглядит наиболее информативным методом. Решение этой проблемы видится в применении методов пробоподготовки, позволяющих в ходе обработки клинического образца специфически сепарировать микобактерии от неспецифических бактерий, поскольку высокая консервативность rpoB гена обуславливает амплификацию соответствующего локуса.

Генерозов Э.В. и совт. [11, 12] исследовали эффективность системы выделения микобактерий, основанной на принципе иммуносепарации . Пробоподготовка состояла в следующем: в образцы гомогенизированной с NaOH и N-ацетил-L-цистеином и затем нейтрализованной мокроты вносили иммуномагнитный сорбент, состоящий из ферромагнитных частиц, связанных с моноклональными антителами к МБТ. После инкубации магнитные частицы собирали на сменных пластиковых наконечниках с магнитным сердечником. Собранный материал подвергали лизису в микрообъеме с Тритоном Х-100 при 95 о С и использовали для проведения ПЦР [10].

Всего в ходе исследования было проанализировано 12 образцов мокроты. Каждый из образцов делили на три части, одну из которых сразу обрабатывали вышеуказанным способом. Выделенную ДНК использовали для ПЦР-амплификации rpoB гена и последующей детекции мутаций методом прямого секвенирования. Вторая часть использовалась для 5-ти дневного культивирования в среде Школьниковой, после чего образцы обрабатывали методом иммуносепарации и анализировали на наличие мутаций. Третья часть материала мокроты была использована для классических культуральных исследований с определением чувствительности к рифампицину как на среде Левенштейна-Йенсена, так и с помощью автоматического флуоресцентного детектора роста микобактерий МВ/ Вас (Organon Teknica).

В ходе работы удалось успешно амплифицировать исследуемый фрагмент rpoB гена в большинстве образцов, полученных непосредственно из мокроты и во всех образцах, полученных после пятидневного культивирования. Специфичность амплификации rpoВ гена была подтверждена в ходе прямого секвенирования соответствующих ПЦР-фрагментов. В шести из 12-ти образцов были выявлены специфические мутации в rpoВ гене, ассоциированные с резистентностью к рифампицину. Пять из них представлены наиболее встречающейся мутацией в 531 кодоне и одна – точечной мутацией в 526 кодоне. Сравнение данных по лекарственной устойчивости, полученных в ходе параллельного микробиологического исследования этих же образцов, показало их соответствие с результатами прямого секвенирования rpoВ гена в 11-ти из 12-ти (91%) проанализированных случаев. Описанная процедура пробоподготовки проста в исполнении, не требует применения дорогостоящего оборудования и позволяет эффективно сепарировать микобактерии в клиническом материале для последующих этапов исследования.

В целом, с учетом изложенного, прямое секвенирование ПЦР фрагментов rpoB гена выглядит наиболее универсальным генотипическим методом детекции резистентности к рифампицину. Наибольшая информативность такого подхода позволяет максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций и правильно оценить резистентность исследуемых штаммов, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности. Немаловажно, что при большей информативности по сравнению с другими методами себестоимость одного анализа путем прямого секвенирования, чем при использовании набора INNO-LiPA Rif.TB и составляет $3. С технической точки зрения, анализы такого типа можно проводить в специально оборудованных лабораториях противотуберкулезных диспансеров республиканского, краевого и областного подчинения.

Как диагностический прием прямое секвенирование применимо и для выявления резистентности Mycobacterium tuberculosis к другим противотуберкулезным препаратам. Данный подход был успешно опробован нами для детекции мутаций в гене katG, обуславливающих резистентность Mycobacterium tuberculosis к изониазиду [неопубликованные данные]. К сожалению, молекулярные механизмы резистентности ко многим противотуберкулезным препаратам исследованы недостаточно полно, что пока лимитирует использование генотипических методов для прямой детекции резистентности. Тем не менее, полученные нами данные свидетельствуют, о том, что, в отношении выявления устойчивости к рифампицину, такой подход уже сейчас представляет реальную альтернативу микробиологическим методам и позволит вести эффективный мониторинг клинических штаммов в реальном масштабе времени.

Применение методов генодиагностики в эпидемиологических исследованиях

Данные о распределении мутаций в локусах антибиотикорезистентности Mycobacterium tuberculosis могут представлять и определенный эпидемиологический интерес. Предполагаемая ранее частота селективно отобранных единичных генетических изменений в 10-7 - 10-8 [54] не соответствует современному темпу увеличения числа резистентных штаммов. Очевидно, что инфицирование первично резистентными бактериями происходит более часто, чем считалось ранее. В ряде случаев удавалось установить и индивидуальную эпидемиологическую взаимосвязь между пациентами, инфицированными штаммами, несущими уникальные двойные мутации [37]. Тем не менее, как правило, штаммовые особенности Mycobacterium tuberculosis и полиморфизм мутаций в rpoB гене напрямую не связаны, и для объективной эпидемиологической информации необходимо одновременно с детекцией резистентности проводить молекулярное типирование штамма [35, 45].

В 1999 г. Генерозовым Э.В. и соавт. [11] было осуществлено комбинированное исследование группы из 65 клинических изолятов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных из различных регионов Российской Федерации. Спектр мутаций, ассоциированных с резистентностью к рифампицину, был определен в ходе прямого секвенирования ПЦР-фрагментов rpoВ гена.В исследуемой группе было обнаружено 11 типов мутаций, затрагивающих пять кодонов rpoВ гена. Доминирующими в исследуемой выборке оказались мутации, затрагивающие 531 (62,7%), 526 (18,6%) и 516 (10,2%) кодоны rpoВ гена.

Генотипирование исследуемой выборки штаммов было осуществлено методами IS61 110-RFLP и DRE-PCR. Первый метод основан на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов элемента IS6110. Этот элемент встречается в геноме от 1-ой 25-ти копий и варьирует по своему положению. Метод DRE-PCR – основан на полиморфизме элемента IS6110 и поли GC-богатых повторов. Поскольку оба этих генетических маркера являются повоторяющимися элементами генома, то метод получил название – ПЦР по двойным повторным элементам.

Применение метода IS6110-RFLP позволило дискриминировать исследованные изоляты на 42 генетически независимые группы, а использование метода DRE-PCR – дискриминировать группу из 27 групп (по номенклатуре СDC).

Рисунок 6.

Уникальные электрофоретические профили, полученные в ходе DRE-PCR анализа 65 клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. М – маркер молекулярного веса (100bp DNA Ladder, "Promega"), К- отрицательный контроль.

Конечная компиляция результатов генотипирования, полученных этими методами, позволила выделить в исследуемой выборке 52 штамма. Анализ полученных генетических вариантов выявил преобладание W- штаммов M.tuberculosis.

Заключение

Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики, основанных на применении полимеразной цепной реакции, значительно повышает эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса по сравнению с традиционными микробиологическими методами (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, посев). При туберкулезе органов дыхания преимущество ПЦР наиболее ощутимо при недеструктивных и ограниченных формах болезни. При внелегочных формах болезни, характеризующихся олигобациллярностью, более адекватной диагностике будут способствовать использование различных способов выделения ДНК, одновременное исследование различных по характеру биологических образцов от одного больного и применение туберкулино-провокационных проб .

Сочетание молекулярных методов типирования микобактерий туберкулеза с методами прямой детекции (секвенирование) резистентности к химиопрепаратам позволит в дальнейшем проводить не только статистические мониторинговые эпидемиологические исследования, но и получать достоверные результаты в клинически значимом масштабе времени.

Литература

1. Альварес Фигероа М.В., Лепеха Л.Н., Никоненко Б.В., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Выявление М. tuberculosis в крови методом ПЦР (экспериментальная модель). / В сб.: Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3-ей Всероссийской конференции. М., 2000.-с.277-279.

2. Альтшулер М.Л., Генерозов Э.В., Денисова Т.С., Владимирский М.А., Андросова М.Н., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Адамович Н.В., Говорун В.М. Выявление мутаций в гене rpoВ, обуславливающих резистентность М. tuberculosis к рифампицину. / В сб.: Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Материалы II Всероссийской конференции. М., 1998.-с.94-95.

3. Андросова М.В., Владимирский М.А., Алексеева Г.И. Иммунологический метод идентификации Mycobacterium tuberculosis и M. bovis BCG на основе применения моноклональных антител. // Проблемы туберкулеза. - 1989. - № 6.-с.12-16.5

4. Бардисявичене И., Сосновская А. Сравнительная эффективность BACTEC 460 ТВ и ИФА в диагностике туберкулеза легких. // В сб.: Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза. Материалы научно-практической конференции. Обнинск, 1996.-c-35.

5. Вишневская Е.Б. Особенности выделения ДНК для ПЦР при туберкулезе внелегочных локализаций. // Проблемы туберкулеза. - 1998. - № 5.-с.23-26.

6. Вишневская Е.Б. Проблемы ПЦР-диагностики внелегочного туберкулеза. / В сб.: Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3-ей Всероссийской конференции. М., 2000.-с.281-282.

7. Вишневский Б.И., Мирлина Е.Д. ПЦР-диагностика микобактерий туберкулеза методом полимеразной цепной реакции при туберкулезе различных локализаций. // В сб.: Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза. Материалы научно-практической конференции. Обнинск, 1996.-c. 14.