MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Адельман Д., под ред. - Иммунология

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61
<<< Назад Содержание Дальше >>>

Д. РИА. Этот высокочувствительный метод разработан более 30лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1)известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2)антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3)чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами (см. рис.20.4). Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке (см. гл.20,п.I.Е). Основные недостатки метода— необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

Е. Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1)исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2)во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3)планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4)планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5)под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген—антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора (см. рис.20.5). Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически— по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену (см. рис.20.5). Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с РИА, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

Ж. Иммуноблоттинг— качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1)смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2)мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем— с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

З. Другие методы исследования 1. Непрямая иммунофлюоресценция— метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем— в присутствии меченных флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

2. Методы, основанные на реакции агглютинации. Для реакции агглютинации обычно используют эритроциты (гемагглютинация) или частицы латекса (латекс-агглютинация), покрытые известным антигеном. В присутствии антител к этому антигену происходит агглютинация эритроцитов или частиц латекса. Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антигенам, латекс-агглютинация— для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем РИА и твердофазный ИФА.

II. Определение поверхностных антигенов лимфоцитов— cd

(см. табл.18.8)— широко применяется при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике гемобластозов, иммунодефицитов и других заболеваний, обусловленных нарушением иммунитета, а также для контроля за приживлением трансплантата и эффективностью иммунотерапии. В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.

А. Моноклональные антитела вырабатываются гибридомами, которые образуются при слиянии миеломных клеток с нормальными плазматическими клетками. Для фенотипирования лимфоцитов человека используют мышиные моноклональные антитела. Моноклональные антитела используются не только для выявления разных типов клеток, но и для изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов.

Б. Флюорохромы— это вещества, которые поглощают падающий свет определенной длины волны и излучают поглощенную энергию в виде света большей длины волны. В большинстве случаев антитела метят флюоресцеина изотиоцианатом или фикоэритрином. Оба вещества флюоресцируют под действием света с длиной волны 488нм, при этом флюоресцеина изотиоцианат излучает зеленый, а фикоэритрин— оранжевый свет. Новый флюорохром— перидинин— также флюоресцирует под действием света с длиной волны 488нм, но излучает красный свет. Использование трех флюорохромов, поглощающих возбуждающий свет одной длины волны, позволяет одновременно определять три разных поверхностных антигена. Другие флюорохромы, например техасский красный, родамин, аллофикоцианин, применяются лишь с исследовательской целью.

В. Проточный цитофлюориметр— прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки: размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла.

Г. В большинстве клинических лабораторий для определения поверхностных антигенов лимфоцитов используют цельную кровь. Суть метода заключается в следующем: 1)к небольшому объему цельной крови добавляют меченные флюорохромом моноклональные антитела; 2)после инкубации, необходимой для связывания антител с антигенами клеточной поверхности, разрушают эритроциты; 3)с помощью проточного цитофлюориметра анализируют клеточный состав пробы.

Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (T-, B- и NK-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют T-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитовCD4/CD8 превышает1, как правило, оно составляет 1,5—2, остальные 30% приходятся на B- и NK-лимфоциты. В клинических лабораториях проточная цитофлюориметрия широко применяется для определения содержания лимфоцитовCD4 при ВИЧ-инфекции. Проточная цитофлюориметрия становится стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов. Результаты проточной цитофлюориметрии, как правило, не позволяют поставить диагноз, но дают важную информацию для его уточнения.

III. Оценка функциональной активности лимфоцитов

А. B-лимфоциты 1. Исследование функций B-лимфоцитов in vivo а. Исследование функций B-лимфоцитов начинают с определения уровня иммуноглобулинов в сыворотке. Для этого чаще всего применяют нефелометрию и простую радиальную иммунодиффузию. Результаты исследования оценивают с учетом возраста (см. приложенияIV и V). Пол и расовая принадлежность почти не влияют на уровень иммуноглобулинов в сыворотке.

б. Для углубленной оценки гуморального иммунитета определяют уровень подклассовIgG. Хотя в большинстве случаев изменение уровня подклассов IgG не сопровождается выраженными клиническими проявлениями, у больных с рецидивирующими инфекциями относительное содержание подклассов IgG значительно отличается от нормы. При этом общий уровень IgG и других иммуноглобулинов может быть нормальным. Поскольку определение подклассов IgG— дорогостоящий метод, он применяется в редких случаях. Наряду с определением подклассов IgG при диагностике иммунодефицитов оценивают также гуморальный иммунный ответ на определенные антигены (см. гл.20,п.III.А.1.в).

в. Определение антител к белковым и полисахаридным антигенам. Этот метод основан на определении уровня антител к белковым (например, столбнячному и дифтерийному анатоксинам) и полисахаридным (например, пневмококковой вакцине) антигенам до и после вакцинации. Он применяется лишь в специализированных лабораториях. Нарушение продукции антител к белковым и полисахаридным антигенам подтверждает недостаточность гуморального иммунитета и свидетельствует о необходимости назначения нормального иммуноглобулина для в/в введения (даже при нормальном уровне иммуноглобулинов сыворотки). Определение продукции антител к полисахаридным антигенам у детей младше 2лет малоинформативно и обычно не проводится (см. гл.18,пп.IV.А.2.а—б).

2. Исследование функций B-лимфоцитов in vitro. Это исследование оценивает способность B-лимфоцитов к дифференцировке в плазматические клетки и выработке ими иммуноглобулинов в ответ на неспецифический (митоген) и специфический (антиген) стимул в культуре клеток. Его обычно проводят только в научных целях.

Б. T-лимфоциты 1. Исследование функций T-лимфоцитов in vivo а. Абсолютное число лимфоцитов. Поскольку в норме T-лимфоциты составляют около 70% всех лимфоцитов крови, существенное снижение числа T-лимфоцитов значительно больше сказывается на общем числе лимфоцитов, чем снижение B- или NK-лимфоцитов.

б. Кожные пробы позволяют оценить способность T-лимфоцитов вызывать аллергическую реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят дерматофитин0, Трихофитон, антиген вируса эпидемического паротита, очищенный туберкулин, столбнячный и дифтерийный анатоксины (см. гл.18,п.III.Ж). Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета. Важную роль в диагностике иммунодефицитов играют также данные анамнеза. Так, если в прошлом отмечался аллергический контактный дерматит (например, вызванный ядоносным сумахом), недостаточность клеточного иммунитета маловероятна.

2. Исследование функций T-лимфоцитов in vitro а. Пролиферативную активность T-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем случае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Интенсивность синтеза ДНК оценивают по включению в нее меченных радиоактивным изотопом нуклеозидов, например 3H-тимидина. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции— отношение радиоактивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части T-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3сут. Антиген стимулирует пролиферацию только тех T-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5—7сут. Для оценки пролиферативной активности T-лимфоцитов, как и при проведении кожных проб, применяют набор широко распространенных антигенов. У ВИЧ-инфицированных пролиферативная реакция T-лимфоцитов на распространенные антигены может быть снижена уже на ранних стадиях заболевания. Прогрессирование ВИЧ-инфекции и других иммунодефицитов сопровождается снижением реакции T-лимфоцитов на аллоантигены, а впоследствии— и на митогены. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.

б. Оценка цитотоксичности. Обычно оценивают цитотоксичность, ограниченную по HLA, опосредованную лимфоцитамиCD8 (см. гл.17,п.II.А.1.а). Клетками-мишенями служат собственные клетки, несущие на своей поверхности чужеродный антиген, связанный с антигенами HLA классаI. ЛимфоцитыCD8 играют важную роль в защите от вирусных инфекций. Наряду с лимфоцитамиCD8 ограниченную по HLA цитотоксичность осуществляют некоторые лимфоцитыCD4, распознающие антиген в комплексе с антигенами HLA классаII. Обе субпопуляции лимфоцитов несут антигенраспознающий рецептор, образованный альфа- и бета-цепями. ЛимфоцитыCD8 с антигенраспознающим рецептором, образованным гамма- и дельта-цепями, участвуют в цитотоксичности, не ограниченной по HLA. Эти лимфоциты присутствуют в крови в незначительном количестве и разрушают клетки-мишени подобно NK-лимфоцитам, то есть без предварительной иммунизации (см. гл.20,п.III.B). Оценка клеточной цитотоксичности необходима для диагностики иммунодефицитов. Оценку цитотоксической активности лимфоцитов проводят следующим образом: 1)клетки-мишени обрабатывают радиоактивной меткой (51Cr); 2)к меченым клеткам-мишеням добавляют исследуемые лимфоциты; 3)гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Полученные результаты сравнивают с нормальными показателями. При исследовании ограниченной по HLA цитотоксичности исследуемые T-лимфоциты предварительно инкубируют с антигеном, присутствующим на клетках-мишенях.

в. Исследование цитокинов. Активированные лимфоциты вырабатывают биологически активные вещества— цитокины (см. гл.1,п.IV.Б). Их уровень определяют с помощью готовых наборов для РИА и твердофазного ИФА. Существуют и более трудоемкие методы исследования цитокинов, основанные на оценке их биологических функций. Оценить содержание цитокинов in vivo довольно сложно, поскольку они прочно связаны с клеточными рецепторами, а в сыворотке и других биологических жидкостях быстро разрушаются.

В. Исследование функций NK-лимфоцитов 1. Цитотоксичность NK-лимфоцитов не зависит от предварительной иммунизации и не ограничена по HLA. Цитотоксическую активность NK-лимфоцитов оценивают с помощью метода, описанного в гл.20,п.III.Б.2.б, используя в качестве клеток-мишеней разные линии трансформированных клеток, чувствительных к действию NK-лимфоцитов. Разрушение клеток-мишеней осуществляется лишь при образовании тесного контакта с NK-лимфоцитами. Этот контакт может быть прямым или опосредованным, при котором NK-лимфоциты прикрепляются к покрытым IgG клеткам-мишеням через рецептор к Fc-фрагменту IgG— антителозависимая клеточная цитотоксичность. Благодаря этому механизму могут быть разрушены клетки-мишени, первоначально устойчивые к действию NK-лимфоцитов. Антителозависимую клеточную цитотоксичность оценивают с помощью стандартного метода (см. гл.20,п.III.Б.2.б), используя клетки-мишени, покрытые антителами класса IgG. NK-лимфоциты играют важную роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете и участвуют в отторжении трансплантата. Снижение цитотоксической активности NK-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях, а отсутствие наблюдается крайне редко.

2. Активация NK-лимфоцитов цитокинами. После инкубации с определенными цитокинами цитотоксическая активность NK-лимфоцитов значительно повышается. Так, при добавлении интерферонагамма активность NK-лимфоцитов повышается уже через несколько часов. После инкубации с интерлейкином-2 в течение нескольких суток NK-лимфоциты становятся активными в отношении любых трансформированных клеток-мишеней, в том числе опухолевых клеток. В настоящее время исследуется возможность применения активированных цитокинами NK-лимфоцитов при некоторых злокачественных новообразованиях.

IV. Исследование функций фагоцитов

А. Моноциты и макрофаги. С помощью лабораторных методов можно оценить следующие функции моноцитов и макрофагов: представление антигена T-лимфоцитам, антителозависимую клеточную цитотоксичность, противоопухолевую цитотоксичность, хемотаксис, фагоцитоз и бактерицидную активность. Кроме того, можно исследовать продукцию цитокинов активированными макрофагами. Исследование функции моноцитов и макрофагов проводят при недостаточности клеточного иммунитета, атипичных и оппортунистических инфекциях. Это исследование проводится лишь в некоторых специализированных лабораториях.

Б. Нейтрофилы. Исследуют такие функции нейтрофилов, как хемотаксис, фагоцитоз, бактерицидную активность, продукцию свободных радикалов кислорода и адгезию.

1. Хемотаксис нейтрофилов исследуют с помощью камеры Бойдена. Эта камера состоит из двух отделений, между которыми находится фильтр. В одно отделение камеры помещают суспензию нейтрофилов, в другое— хемотаксический фактор, например C5a. После инкубации нейтрофилов в камере Бойдена определяют, какое их количество мигрировало на противоположную сторону фильтра. Другой способ исследования хемотаксиса нейтрофилов основан на применении полужидкого агара. Для исследования хемотаксиса нейтрофилов in vivo используется метод кожного окна (см. гл.18,п.IV.В.4.а). Нарушение хемотаксиса нейтрофилов характерно для синдрома Чедиака—Хигаси и иногда наблюдается при синдроме гиперпродукции IgE. У больных со слабо выраженной воспалительной реакцией также выявляется снижение хемотаксиса нейтрофилов in vitro.

2. Продукция свободных радикалов кислорода. Активация нейтрофилов сопровождается повышением активности гексозо-монофосфатного шунта, потреблением кислорода и образованием перекиси водорода и свободных радикалов кислорода. Продукцию этих радикалов можно оценить с помощью теста восстановления нитросинего тетразолия и хемилюминесценции (см. гл.18,пп.IV.В.1). Отсутствие восстановления нитросинего тетразолия— характерный признак хронической гранулематозной болезни. Результаты, полученные с помощью теста восстановления нитросинего тетразолия и хемилюминесценции, обычно совпадают.

3. Оценка бактерицидной активности нейтрофилов. Суть метода заключается в следующем: 1)к нейтрофилам добавляют опсонины и суспензию бактерий; 2)после инкубации определяют число погибших бактерий (см. гл.18,п.IV.В.3). Для оценки бактерицидной активности нейтрофилов используются разные виды бактерий. Для хронической гранулематозной болезни характерно значительное снижение бактерицидной активности нейтрофилов в отношении Staphylococcus aureus.

<<< Назад Содержание Дальше >>>

medbookaide.ru