Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

У азотобактера образование цист сопровождается изменением морфологии клетки, потерей жгутиков и накоплением в цитоплазме в больших количествах гранул поли-b-оксимасляной кислоты; одновременно происходит синтез дополнительных клеточных покровов: внешних (экзина) и внутренних (интина) по отношению к клеточной стенке (рис. 22, 5), различающихся структурно и химическим составом.

Покоящимися клетками некоторых цианобактерий, обладающими повышенной устойчивостью к ряду неблагоприятных факторов (высушиванию, пониженным температурам), являются акинеты. Они, как правило, заметно крупнее вегетативных клеток, имеют продолговатую или сферическую форму, гранулированное содержимое и толстую оболочку. Образование акинет происходит в период замедления роста и начинается с увеличения клеточных размеров, при этом в цитоплазме происходит накопление гранул запасных веществ (гликогеновых, полифосфатных и особенно крупных цианофициновых), а также карбоксисом. Одновременно происходит утолщение пептидогликанового слоя клеточной стенки и уплотнение слизистого чехла за счет отложения в нем электронно-плотного фибриллярного материала полисахаридной природы (рис. 22, В). Оболочки акинет содержат больше липидов и полисахаридов, а цитоплазма — меньше воды, чем вегетативные клетки. В цитоплазме при формировании акинет отмечается увеличение содержания ДНК, рибосом, но уменьшение количества хлорофилла и фикобилиновых пигментов. Тилакоиды образуют сложную сетчатую структуру. Скорость фотосинтеза в акинетах ниже, а дыхание выше, чем в вегетативных клетках. Прорастание акинет происходит иногда вскоре после их образования или только после перенесения в свежую питательную среду и может осуществляться двумя путями: иногда в акинете на одном из полюсов формируется пора, через которую выходит проросток, или же прорастание происходит в результате разрыва оболочки акинеты.

Образование эндоспор — процесс, имеющий место только в мире прокариот. Бактериальные эндоспоры — это особый тип покоящихся клеток грамположительных эубактерий, формирующихся эндогенно, т. е. внутри цитоплазмы "материнской" клетки (спорангия), обладающих специфическими структурами (многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мембранами, кортексом) и устойчивостью к высоким температурам и дозам радиации, летальным в норме для вегетативных клеток (рис. 22, Г). Эндоспорам свойственно также и особое физическое состояние протопласта.

Таблица 7 Эубактерии, образующие эндоспоры (по Дуде, 1982)

К спорообразующим относится большое число эубактерий приблизительно из 15 родов, характеризующихся морфологическим и физиологическим разнообразием (табл. 7). Среди них имеются палочковидные, сферические, мицелиальные формы, спириллы и нитчатые организмы. Все они имеют строение клеточной стенки, характерное для таковой грамположительных эубактерий. Ни в одном случае не выявлена наружная липопротеиновая мембрана, несмотря на то, что многие роды и виды спорообразующих бактерий не окрашиваются по Граму. По типу питания среди них обнаружены хемоорганогетеротрофы, факультативные хемолитоавтотрофы и паразитические формы. Отношение к кислороду также разнообразно: часть спорообразующих форм представлена аэробами и факультативными анаэробами, другая часть включает облигатных анаэробов — от аэротолерантных форм до высокочувствительных к O2.

Лучше всего процесс спорообразования изучен у представителей родов Bacillus и Clostridium, хотя имеющиеся данные позволяют сделать вывод о принципиальной однотипности этого процесса у всех видов, образующих эндоспоры. В каждой бактериальной клетке, как правило, формируется одна эндоспора14. Первым шагом к спорообразованию является изменение морфологии ядерного вещества вегетативной клетки, образующего тяж вдоль длинной оси спорулирующей клетки (рис. 23). Приблизительно 1/3 тяжа затем отделяется и переходит в формирующуюся спору. У некоторых видов ядерный тяж образуется только на одном полюсе клетки, в его формировании участвует не весь генетический материал вегетативной клетки, и впоследствии ядерный тяж целиком переходит в формирующуюся спору. Биологический смысл формирования ядерного тяжа до сих пор остается невыясненным.

Формирование споры начинается с того, что у одного из полюсов клетки происходит уплотнение цитоплазмы, которая вместе с генетическим материалом, представляющим собой одну или несколько полностью реплицированных хромосом, обособляется от остального клеточного содержимого с помощью перегородки. Последняя формируется впячиванием внутрь клетки ЦПМ. Мембрана нарастает от периферии к центру, где срастается, что приводит к образованию споровой перегородки. Эта стадия формирования споры напоминает клеточное деление путем образования поперечной перегородки (см. рис. 20, А). Следующий этап формирования споры — "обрастание" отсеченного участка клеточной цитоплазмы с ядерным материалом мембраной вегетативной клетки, конечным результатом которого является образование проспоры — структуры, расположенной внутри материнской клетки и полностью отделенной от нее двумя элементарными мембранами: наружной и внутренней по отношению к проспоре.

Описанные выше этапы формирования споры (вплоть до образования проспоры) обратимы. Оказалось, что если к спорулирующей культуре добавить антибиотик хлорамфеникол (ингибитор белкового синтеза и, следовательно, ингибитор синтеза мембранных белков), то можно остановить "обрастание" клеточной мембраной отсеченного септой участка цитоплазмы, и процесс спорообразования превратится в процесс клеточного деления. (Между двумя мембранами септы откладывается материал клеточной стенки.) После образования проспоры дальнейшие этапы спорообразования уже необратимы. Между наружным и внутренним мембранными слоями проспоры начинается формирование кортикального слоя (кортекса). Затем поверх наружной мембраны проспоры синтезируются споровые покровы, состоящие из нескольких слоев, число, толщина и строение которых различны у разных видов спорообразующих бактерий. В формировании слоев споровых покровов принимает участие как наружная мембрана споры, так и протопласт материнской клетки.

14 Описана анаэробная бактерия, образующая в клетке до 3—5 эндоспор.

У многих бактерий поверх покровов споры формируется еще одна структура — экзоспориум, строение которого различно в зависимости от вида бактерий. Часто экзоспориум многослойный, с характерной для каждого слоя тонкой структурой. Все слои, окружающие протопласт эндоспоры, находятся внутри материнской клетки. На их долю приходится примерно половина сухого вещества споры. После сформирования споры происходит разрушение (лизис) "материнской" клеточной стенки, и спора выходит в среду.

Спорообразование сопровождается активным синтезом белка. Белки эндоспор в отличие от белков вегетативных клеток богаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, с чем связывают устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов. Содержание ДНК в споре несколько ниже, чем в исходной вегетативной клетке, поскольку в спору переходит лишь часть генетического материала материнской клетки. Генетический материал поступает в спору в виде полностью реплицированных молекул ДНК. Споры некоторых видов содержат по 2 или 3 копии хромосомы. Содержание РНК в спорах ниже, чем в вегетативных клетках, и РНК в значительной степени при спорообразовании синтезируется заново. Одним из характерных процессов, сопровождающих образование эндоспор, является накопление в них дипиколиновой кислоты и ионов кальция в эквимолярных количествах. Эти соединения образуют комплекс, локализованный в сердцевине споры. Помимо Са2+ в эндоспорах обнаружено повышенное содержание других катионов (Mg2+, Mn2+, K+), с которыми связывают пребывание спор в состоянии покоя и их термоустойчивость.

Существенные отличия эндоспор от вегетативных клеток выявляются при изучении химического состава отдельных споровых структур. Экзоспориум состоит из липидов и белков и, вероятно, выполняет функцию дополнительного барьера, защищающего спору от внешних воздействий, а также регулирующего проникновение в нее различных веществ. Однако никаких данных, подтверждающих эти предположения, пока нет. Механическое удаление экзоспориума не приводит к какому-либо повреждению спор. Они обнаруживают такую же способность к прорастанию, как и споры с неудаленным экзоспориумом.

Споровые покровы в основном состоят из белков и в небольшом количестве из липидов и гликолипидов. Белки покровов обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям и обеспечивают спорам защиту от действия литических ферментов, других повреждающих факторов, а также предохраняют спору от преждевременного прорастания. Оказалось, что споры мутантов, лишенные покровов, прорастают сразу же после выхода из материнской клетки, даже если условия для последующего роста неблагоприятны. Кортекс построен в основном из молекул особого типа пептидогликана. При прорастании споры из части кортекса, прилегающей к внутренней споровой мембране, формируется клеточная стенка вегетативной клетки.

В отличие от эндоспор, образующихся внутри материнской клетки и окруженных двумя элементарными мембранами, экзоспоры бактерий из рода Methylosinus и Rhodomicrobium формируются в результате отпочкования от одного из полюсов материнской клетки. Образование экзоспор сопровождается уплотнением и утолщением клеточной стенки. У экзоспор отсутствуют дипиколиновая кислота и характерные для эндоспор структуры (кортекс, экзоспориум).

У актиномицетов споры являются покоящимися клетками и одновременно репродуктивными структурами. По типу образования они делятся на две группы — эндогенные и экзогенные. Эндогенное образование спор внутри цитоплазмы материнской гифы, обнаруженное у представителей родов Thermoactinomyces и Actinobifida, протекает аналогично описанному выше. У большинства актиномицетов споры формируются экзогенно путем деления гифы перегородками на участки, каждый из которых представляет собой будущую спору. Экзоспоры большинства актиномицетов не содержат каких-либо дополнительных внутренних структур помимо тех, которые наблюдаются в вегетативной клетке. Стенка споры обычно значительно толще, чем стенка гифы, и в ней можно различить несколько слоев разной электронной плотности. Часто клеточная стенка окружена дополнительными наружными покровами.

Покоящиеся клетки эубактерий характеризуются низкими уровнями метаболической активности. В первую очередь это касается дыхания. От степени снижения метаболической активности зависит длительность сохранения жизнеспособности покоящихся клеток. Большой интерес представляет выяснение механизмов, ответственных за поддержание специализированных клеток в состоянии покоя. В настоящее время наибольшее внимание привлекают три гипотезы. Первая основана на том, что в покоящихся клетках имеются вещества, ингибирующие ферменты и, следовательно, блокирующие метаболизм. Из спор некоторых бактерий действительно выделены вещества, предотвращающие прорастание спор. Согласно второй гипотезе сохранение покоя связывают со структурой спор, обеспечивающей поддержание ее сердцевины в обезвоженном состоянии. Наконец, поддержание покоя объясняют особым состоянием ферментов. Изменения их конфигурации, приводящие к активированию ферментов, выводят покоящуюся клетку из этого состояния. Возможно, что поддержание специализированных клеток в состоянии покоя — результат совместного действия всех описанных выше механизмов.

Для всех покоящихся форм характерна повышенная по сравнению с вегетативными клетками устойчивость к действию разнообразных повреждающих факторов: высоких и низких температур, обезвоживанию, высокой кислотности среды, радиации, механических воздействий и др. В наибольшей степени эта устойчивость проявляется у эндоспор. Механизмы устойчивости в настоящее время мало изучены. Для эндоспор основными факторами, обеспечивающими их устойчивость к действию неблагоприятных условий среды, предположительно является нахождение споровой цитоплазмы в обезвоженном состоянии, термостойкость споровых ферментов, а также наличие дипиколиновой кислоты и большого количества двухвалентных катионов. Большой вклад в устойчивость спор вносят поверхностные структуры (мембраны, кортекс, покровы), механически защищающие содержимое споры от проникновения извне агрессивных веществ. Механизм устойчивости к неблагоприятным факторам, основанный на дегидратации клеточных структур, имеет место и у других покоящихся форм эубактерий, так как все они характеризуются пониженным содержанием воды сравнительно с вегетативными клетками.

Условия, способствующие образованию покоящихся клеток, до сих пор изучены недостаточно. К категории благоприятствующих факторов относится наличие или отсутствие определенных питательных веществ среды, температура, кислотность среды, условия аэрирования. Формированию цист у миксобактерий, например, способствует наличие в среде глицерина, аминокислот. Количество цист азотобактера возрастает при добавлении к среде b-оксимасляной кислоты и повышении концентрации двухвалентных катионов. В качестве факторов, индуцирующих формирование акинет цианобактерий, отмечена низкая температура, высушивание, отсутствие в среде связанного азота или, наоборот, увеличение содержания глутаминовой кислоты.

Помимо факторов внешней среды, в неодинаковой степени влияющих на формирование разных типов покоящихся клеток, обнаружены специфические вещества, основная функция которых заключается в регулировании роста и развития эубактерий, в частности в индуцировании процессов формирования покоящихся клеток. Такие вещества могут выделяться в культуральную среду или накапливаться внутри клетки. Они были выделены, и показана индукция ими спорообразования.

Сформированные покоящиеся клетки в течение разного времени могут находиться в жизнеспособном состоянии (табл. 8) и прорастать в подходящих условиях с образованием активно метаболизирующих вегетативных клеток.

Для эндоспор процесс прорастания состоит из нескольких этапов: активации, инициации и вырастания. Как правило, эндоспоры даже в благоприятных условиях могут не прорастать. Для этого их необходимо подвергнуть активации. Наиболее общим активирующим фактором является термообработка споровой суспензии. После этого споры приобретают способность прорастать, но для начала прорастания необходим химический "пусковой" механизм. В качестве веществ, инициирующих прорастание эндоспор, наиболее эффективны углеводы, некоторые аминокислоты и неорганические ионы.

Таблица 8. Устойчивость покоящихся форм эубактерий к экстремальным воздействиям (по Дуде, Пронину, 1981)

В целом прорастание — это процесс, сопровождающийся сложными физиологическими и биохимическими изменениями. Начинается он с интенсивного поглощения спорой воды и набухания. На первом этапе прорастания происходит активация ферментов (и в первую очередь литических), резко возрастает дыхание, т. е. мобилизуется энергия, происходят изменения в химическом составе (из спор удаляется дипиколиновая кислота), идет активный синтез белка и РНК, но репликация ДНК начинается не сразу, а через 1–2 ч после начала прорастания споры. Прежде всего происходят процессы репарации повреждений ДНК, произошедших в период покоя споры. За время прорастания споры теряют до 1/3 первоначальной массы. Последующие этапы состоят в разрушении кортекса, разрыве споровых покровов, выходе сформировавшейся к этому времени структуры, называемой ростовой трубочкой, достраивании ею клеточной стенки и последующем делении сформированной вегетативной клетки (см. рис. 23).

Уровни клеточной организации

У эубактерий можно проследить разные уровни клеточной организации. Подавляющее большинство эубактерий — одноклеточные организмы. Для свободноживущих форм это может быть определено как способность осуществлять все функции, присущие организму, независимо от соседних клеток. В то же время для многих эубактерий отмечается тенденция существовать не в виде одиночных клеток, а формировать клеточные агрегаты (см. рис. 3, 5). Для неподвижных клеток последние есть результат ряда последовательных делений, приводящих к появлению колоний. Однако образование агрегатов клеток наблюдается и у подвижных форм. Часто клетки в агрегатах удерживаются с помощью выделяемой ими слизи. Прочность и долговечность существования таких агрегатов зависят от свойств слизи и условий внешней среды. На этом этапе можно говорить лишь о случайном клеточном объединении, которое не противоречит данному выше определению одноклеточности.

Известны, однако, случаи, когда такое временное агрегирование одноклеточных организмов связано с осуществлением определенной функции. Примером может служить образование плодовых тел миксобактериями, которое делает возможным созревание цист, на что не способны в обычных условиях единичные клетки. В аэробных условиях описано образование строго анаэробными бактериями из рода Clostridium колоний, по внешнему виду напоминающих плодовые тела миксобактерий, в которых спорулирующие клетки и эндоспоры расположены внутри и защищены от кислорода плотным слоем слизи.