Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

В качестве источника азота метаногены используют аммонийный азот или некоторые аминокислоты. Для ряда видов показана способность к азотфиксации. Источником серы могут служить сульфаты, сульфид или серосодержащие аминокислоты.

Конструктивный метаболизм. Большинство известных метаногенов способны расти хемолитоавтотрофно на смеси CO2 + H2 в качестве единственного источника углерода и энергии. Энергию получают, осуществляя следующую реакцию:

4Н2 + CO2 ® CH4 + 2H2O Как видно из этого уравнения, CO2 служит не только единственным источником углерода, но и конечным акцептором электронов при окислении H2. Около 90% использованной CO2 восстанавливается до CH4, что сопровождается синтезом АТФ, и только 10% или меньше включается в вещества клеток.

Фиксация CO2 у автотрофных метаногенов происходит по нециклическому ацетил-КоА-пути, функционирующему и у ацетогенных эубактерий (рис. 107, см. также рис. 62). Ключевым промежуточным соединением этого пути является ацетил-КоА, синтезируемый из двух молекул CO2. Метильная и карбоксильная группы молекулы образуются разными путями. Метильная группа возникает при восстановлении молекулы CO2 до уровня метанола, оставаясь при этом всегда связанной с переносчиком. Карбоксильная группа появляется в результате восстановления второй молекулы CO2 до CO, катализируемого CO-дегидрогеназой. Метальные и карбоксильные группы связываются в реакциях трансметилирования и транскарбоксилирования с образованием активированной уксусной кислоты. Процесс осуществляется при участии уникальных ферментов. Из ацетил-КоА, в результате восстановительного карбоксилирования образуется пируват и далее фосфоенолпировиноградная и щавелевоуксусная кислоты (см. табл. 24), которые служат предшественниками аминокислот и сахаров. Пути фиксации CO2 ацетогенными эубактериями и метаногенными архебактериями различаются коферментами и некоторыми частными реакциями.

Экзогенный ацетат в конструктивный метаболизм включается через ацетил-КоА и далее в серии реакций, функционирующих в восстановительном ЦТК (см. рис. 76). Замкнутости цикла препятствует отсутствие изоцитратдегидрогеназы.

Биосинтез метана. Восстановление CO2 до CH4 требует переноса 8 электронов. Образующиеся на этом пути промежуточные продукты находятся не в свободном состоянии, а остаются связанными с переносчиками. Согласно предложенной модели на первом этапе CO2 связывается с переносчиком углерода, образуя карбоксипроизводное (X1-COOH), которое восстанавливается до формилпроизводного (X1-CHO). Второй этап метаногенеза включает перенос формильной группы на другой переносчик (Х2), который проводит C1-группу через две последовательные восстановительные реакции, приводящие к образованию метилпроизводного (X2-CH3). На уровне образования метиленпроизводного (X2-CH2) в процесс метаногенеза включается экзогенный формальдегид. Соединения, содержащие метильные группы (CH3OH, CH3COOH, CH3NH2 и другие метиламины), подключаются на уровне метилпроизводного. В этой же точке происходит разветвление анаболических и катаболических путей. Функция X2 у метаногенов напоминает функцию тетрагидрофолата у ацетогенных эубактерий (см. рис. 62).

На третьем конечном этапе метаногенеза, наиболее изученном, метильные группы с переносчика поступают на кофермент М (КоМ-SH). Образуется метил-КоМ. Далее следует его восстановление, сопровождающееся распадом комплекса и выделением CH4. Обе реакции катализируются метилредуктазной системой, представляющей сложный мультиферментный комплекс, в состав которого помимо фермента входят кофермент М, фактор F430. Для активности системы необходимы АТФ, ионы Mg2+ и еще не идентифицированные кофакторы.

Кофакторы. У метаногенов обнаружено около 12 необычных кофакторов, участвующих в первичном метаболизме углерода и водорода.

Кофермент М — 2-меркаптоэтансульфоновая кислота:

Наиболее просто устроенный из известных коферментов. Переносчик и донор метильных групп. Служит субстратом для метилредуктазной системы, катализирующей восстановление метил-КоМ до CH4.

Фактор F420 — производное 5-деазафлавина (рис. 108, А). В окисленном состоянии при нейтральном и щелочном значении pH имеет характерный максимум поглощения при 420 нм. Переносчик электронов с низким окислительно-восстановительным потенциалом ( —380 мВ). Вероятно, выполняет функцию акцептора электронов от гидрогеназы.

Фактор F430 — никельсодержащий тетрапиррол (рис. 108, Б); компонент метилредуктазной системы, участвует в восстановлении метильной группы метил-КоМ до CH4.

Метаноптерин (рис. 108, В) участвует в переносе C1-групп в процессе восстановления CO2 до CH4 на уровне метенил-, метилен- и метилпроизводных.

Метанофуран (рис. 108, Г) также участвует в переносе C1-групп в процессе восстановления CO2 до CH4.

Фактор FB необходим для функционирования метилредуктазной системы. Структура пока не установлена.

Определенная роль в процессе метаногенеза принадлежит корриноидам — производным аналогов витамина B12. Их функции связаны с переносом метильных групп. Считают, что метаногены могут при определенных условиях образовывать активные B12-зависимые метилтрансферазы, участвующие в синтезе метана.

Энергетические процессы. Как отмечалось выше, почти все метанобразующие бактерии могут получать энергию за счет окисления H2, сопряженного с восстановлением CO2. Опытами с меченым водородом показано, что H2 в этом процессе служит только донором электронов, а источником протонов в молекуле метана является вода.

Многие виды для получения энергии могут использовать формиат:

4HCOOH ® CH4 + ЗCO2 + 2H2O.

Для некоторых представителей показана способность образовывать метан при использовании метанола:

4CH3OH ® ЗCH4 + CO2 + 2H2O а также метилированных аминов.

У ряда метаногенов обнаружена способность окислять окись углерода, что также сопровождается синтезом метана:

4CO + 2H2O ® CH4 + ЗCO2.

Наконец, представители нескольких родов могут использовать в качестве источника энергии и углерода ацетат:

Таким образом, акцепторами электронов (а в ряде случаев и донорами, и акцепторами) у метанобразующих бактерий является ряд одноуглеродных соединений (CO2, CO, формиат, метанол, метилированные амины) и единственное двухуглеродное соединение — ацетат.

Механизм энергетических процессов метаногенов еще не расшифрован, но общие принципиальные положения установлены. Ясно, что получение энергии, по крайней мере при окислении H2, сопряженном с восстановлением CO2, связано с функционированием электронтранспортной системы, включающей дегидрогеназы, переносчики электронов и редуктазы, т. е. определенным видом анаэробного дыхания.

Перенос электронов приводит к образованию трансмембранного протонного градиента, разрядка которого с помощью мембранной АТФ-синтазы сопровождается синтезом АТФ. Доказательством получения метанобразующими бактериями энергии в результате окислительного фосфорилирования служит подавление у них образования АТФ при действии разобщителей и ингибиторов АТФазы. Мало, однако, известно об электронных переносчиках. Не изучена организация дыхательной цепи и ее H+-переносящих участков.

В качестве дегидрогеназ идентифицированы гидрогеназа и формиатдегидрогеназа. От H2 перенос электронов катализируется связанной с мембраной гидрогеназой, с которой они акцептируются фактором F420. С последнего электроны поступают на НАДФ+. Вероятно, и восстановленный фактор F420 и НАДФ-H2 служат донорами электронов для восстановительных превращений C1-групп у метаногенов. Окисление формиата также сопряжено с восстановлением фактора F420 и последующим образованием НАДФ-H2.

Долгое время считали, что у метанобразующих бактерий нет электронных переносчиков, типичных для эубактерий, имеющих электронтранспортные цепи. Недавно у Methanosarcina barken найдены ферредоксин Fe3S3-типа и цитохромы типа b и c. Последние обнаружены также у других видов, способных использовать в качестве энергетических субстратов соединения, содержащие метильные группы (метанол, метилированные амины, ацетат). У метаногенов, растущих только на среде, содержащей смесь H2 + CO2 или формиат, цитохромы не найдены. Из хинонов обнаружены g- и a-токоферохиноны; менахинонов нет.

Терминальные этапы катализируются соответствующими ре-дуктазами, из которых наиболее изучена метилредуктазная система. Реакция, катализируемая метилредуктазой, является общей при образовании метана из различных субстратов (CO2, CO, метанол, ацетат), и именно с ней связано получение клеткой энергии. Фермент локализован в мембране, и его функционирование приводит к трансмембранному перемещению протонов. На 1 молекулу образованного метана приходятся 4 транслоцированных H+.

Открыта способность метанобразующих бактерий использовать в качестве конечного акцептора электронов вместо CO2 молекулярную серу. В присутствии S0 и обычных энергетических субстратов (H2 или метанол) наблюдается образование значительного количества H2S при одновременном снижении в 2–10 раз синтеза CH4.

Таким образом, метанобразующие бактерии способны осуществлять энергетический метаболизм хемолито- или хемоорганотрофного типа, сочетая его с конструктивным обменом авто- или гетеротрофного типа.

Экология и роль в природе. Метаболические свойства метанобразующих бактерий (строгий анаэробиоз, зависимость от ограниченного набора ростовых субстратов, и в первую очередь от молекулярного водорода) определяют их распространение в природе. Обычными местами обитания этих бактерий является анаэробная зона разных водоемов, богатых органическими соединениями. Они обнаруживаются в иловых отложениях озер и рек, в болотах и заболоченных почвах, в осадочных слоях морей и океанов. Метанобразующие бактерии — обитатели пищеварительного тракта животных и человека, а также важный компонент микрофлоры рубца жвачных животных.

Так как метаногены используют ограниченный набор субстратов, их распространение в природе тесно связано с развитием образующих эти субстраты микроорганизмов. Совместно с последними метанобразующие бактерии обеспечивают протекание в природе важного крупномасштабного процесса — анаэробного разложения органических соединений, в первую очередь целлюлозы. Выделяют 3 основные стадии анаэробного разложения органического вещества. Первая — определяется деятельностью микроорганизмов с активными гидролитическими ферментами. Они разлагают сложные органические молекулы (белки, липиды, полисахариды) на более простые органические соединения. Вторая стадия связана с активностью водородобразующих бродильщиков, конечными продуктами метаболизма которых являются H2, CO2, CO, низшие жирные кислоты (в первую очередь ацетат) и спирты. Завершают анаэробную деструкцию органического вещества метанобразующие бактерии. Поскольку главным экологическим фактором, определяющим развитие метаногенов, является выделение H2, в природе созданы и существуют ассоциации между водородвыделяющими и метанобразующими бактериями. Примером такой естественной системы могут служить бактериальные ассоциации, обитающие в рубце жвачных животных и обеспечивающие разложение целлюлозы, пектина и других органических субстратов. О масштабности процессов, связанных с деятельностью мета-нобразующих бактерий, свидетельствует тот факт, что более 20% мировых запасов CH4 имеют биогенное происхождение.

Метанобразующие бактерии представляют определенный практический интерес как продуценты витамина B12 и газообразного топлива — метана.

Возможное место в эволюции. Вхождение метаногенов в состав архебактерий указывает на их древнейшее происхождение. Данные о составе атмосферы первобытной Земли позволяют предполагать, что метаногены могли возникнуть около 3–3,5 млрд лет назад. Предшественниками их могли быть первично анаэробные бродильщики, поскольку метаногены обладают более высокоорганизованным механизмом получения энергии по сравнению с брожением. Но последующее уменьшение в биосфере необходимого для них источника энергии — молекулярного водорода — привело к тому, что метаногены оказались эволюционно тупиковой ветвью.

Архебактерий без клеточной стенки

В 1970 г. из каменного угля, подверженного саморазогреванию, изолирован организм, морфологически и цитологически сходный с микоплазмами. Облигатный термофил: оптимальная температура роста — 59°, нижняя и верхняя границы роста — 45 и 62° соответственно. Оптимальная кислотность — pH 1-2. Организм получил название Thermoplasma acidophilum. Хотя отсутствие клеточной стенки сближает его с микоплазмами, данные по 16S рРНК и другие фенотипические признаки указывают на филогенетическую связь с архебактериями.

ЦПМ Т. acidophilum толщиной 5 — 10 нм, построенная преимущественно из фосфо- и гликолипидов, в основе которых лежит бифитаниловый тетраэфир диглицерина, обнаруживает необычайную устойчивость к действию высокой температуры, низкого pH, литических ферментов, детергентов и осмотического шока.

Геном Т. acidophilum — наименьший из всех известных геномов, обнаруженных у свободноживущих прокариот, и составляет примерно 1/3 генома Е. coli.

У Т. acidophilum функционирует модифицированный путь Энтнера — Дудорова катаболизирования сахаров, приводящий к синтезу АТФ в реакциях субстратного фосфорилирования (см. рис. 105). Факультативный аэроб. В клетках обнаружены менахинон, цитохромы типа b, с, d, цитохромоксидаза, что указывает на возможность функционирования электронтранспортной системы. Вопрос о возможности получения энергии этим организмом за счет окислительного фосфорилирования не ясен.

Естественная экологическая ниша термоплазмы не известна. Она легко выделяется из саморазогревающихся антропогенных угольных куч. Есть сообщения о выделении Thermoplasma из горячих источников. Некоторые исследователи рассматривают Т. acidophilum в качестве организма, предки которого приняли участие в создании эукариотной клетки, став ее ядерно-цитоплазматическим компонентом.

Архебактерий, восстанавливающие сульфаты

В 1987 г. описана строго анаэробная архебактерия, выделенная в род Archaeoglobus, способная восстанавливать сульфат до H2S в процессе диссимиляционной сульфатредукции. Клетки кокковидной формы окружены клеточной стенкой, построенной из гликопротеиновых субъединиц и окрашивающейся отрицательно по Граму. Экстремальный термофил, верхняя граница роста 92?. Донорами электронов могут служить H2, формиат, лактат, глюкоза, дрожжевой экстракт. Кроме сульфата в качестве конечного акцептора электронов могут использовать сульфит и тиосульфат, но не молекулярную серу.

Особенность Archaeoglobus, привлекшая внимание исследователей, — способность в небольшом количестве образовывать метан Подобно типичным метанобразующим бактериям в клетках Archaeoglobus содержатся фактор F420 и метаноптерин, но не обнаружены кофермент М и фактор F430.

Результаты определения нуклеотидной последовательности 16S рРНК позволяют рассматривать Archaeoglobus как форму, занимающую промежуточное положение между метаногенами и экстремальными термофилами, метаболизм которых связан с восстановлением или окислением молекулярной серы.

Экстремальные термофилы, метаболизирующие молекулярную серу

В группу входят организмы, составляющие по данным изучения нуклеотидной последовательности 16S рРНК вторую эволюционную ветвь архебактерий. Образующие ее серозависимые архебактерии разнородны в морфологическом, физиологическом и, как следствие этого, систематическом отношении. В IX издании Определителя бактерий Берги они подразделяются на 3 порядка, 4 семейства и включают 9 родов. Однако в литературе описан еще ряд организмов, выделенных в новые роды в рамках этой группы, и список их постоянно растет.

Группа объединяет клетки разной морфологии: кокки, палочки, диски, нити или неправильной дольчатой формы. Клеточные стенки, окрашивающиеся отрицательно по Граму, построены из гликопротеиновых или белковых субъединиц. Мембраны монослойные, содержат липиды, построенные на основе тетраэфиров глицерина. Бифитанильные цепи содержат от 1 до 4 пятичленных циклических группировок.

Источником углерода для роста служат разнообразные органические соединения (белки, пептиды, отдельные аминокислоты, углеводы, кислоты) и CO2. Разные представители в этом плане существенно различаются: большинство — облигатные гетеротрофы, некоторые — факультативные и облигатные автотрофы. Автотрофная ассимиляция CO2 происходит, вероятно, по восстановительному ЦТК. Углеводы, что показано по крайней мере для Sulfolobus, катаболизируются по модифицированному пути Энтнера–Дудорова (см. рис. 105).

Своеобразен энергетический метаболизм экстремально термофильных архебактерий. Он облигатно или факультативно связан с метаболизмом молекулярной серы. Основные способы получения энергии включают аэробное или анаэробное (серное) дыхание, а также брожение (табл. 34). Перечисленные в таблице способы энергетического существования экстремально термофильных архебактерий не исчерпывают всех, описанных к настоящему времени у отдельных представителей.

Наиболее полно в этом отношении изучены представители рода Sulfolobus, входящие в порядок Sulfolobales. Это облигатно или факультативно аэробные организмы. Способны к росту в авто- или гетеротрофных условиях при использовании в качестве источника энергии H2S и/или S0, которые окисляют до H2SO4, понижая pH среды до 1 и ниже. У Sulfolobus и других архебактерий, метаболизирующих молекулярную серу, отсутствует периплазматическое пространство. Окисление S0 происходит, вероятно, на наружной поверхности ЦПМ. Некоторые виды Sulfolobus могут окислять не только S0, но и Fe2+, а также сульфиды металлов. При недостатке O2 могут окислять S0 в анаэробных условиях, используя в качестве конечного акцептора электронов Fe3+ или Mo6+, восстанавливая последний до Mo5+.

Таблица 34. Основные способы получения энергии экстремально термофильными архебактериями