Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

В митохондриях на 3 участках окислительной цепи происходит выделение протонов во внешнюю среду. Соответственно 3 реакции ведут к образованию DmH+ (рис. 96). Первая локализована в начале дыхательной цепи и связана с функционированием НАД(Ф)-H2-дегидрогеназы. Второй генератор DmH+ определяется способностью убихинона переносить водород. Последний локализован в конце дыхательной цепи и связан с активностью цитохромоксидазы.

Поскольку синтез молекулы АТФ связан, как минимум, с переносом 2 протонов через АТФ-синтазу, а при окислении НАД(Ф)-H2 молекулярным кислородом, т. е. поступлении 2 электронов на 1/2O2 выделяются 6H+, максимальный выход АТФ в этом .процессе составляет 3 молекулы. Для количественной оценки эффективности фосфорилирования при переносе электронов используют отношение P/O, означающее количество потребленных молекул неорганического фосфата, приходящихся на 1 поглощенный атом кислорода. H2 препаратах изолированных митохондрий показано, что при переносе водорода от изолимонной или яблочной кислот на НАД+, а затем на молекуляроный кислород отношение P/O равно 3. Приокислении янтарной кислоты, водород которой переносится на сукцинатдегидрогеназу и далее на убихинон, возможны только 2 фосфорилирования, так как при этом выпадает участок дыхательной цепи, где локализован первый генератор DmH+. Таким образом, место включения электронов от разных субстратов в цепь их дальнейшего транспорта определяет число функционирующих протонных помп в дыхательной цепи.

Теперь можно подвести итог тому, каков энергетический выход при окислении молекулы глюкозы, осуществляемом в максимально отлаженной энергетической системе, функционирующей в эукариотных клетках: гликолиз ® ЦТК ® дыхательная цепь митохондрий. H2 первом этапе в процессе гликолитичес-кого разложения молекулы глюкозы образуются по 2 молекулы пирувата, АТФ и НАД-H2. Конечными продуктами реакции окислительного декарбоксилирования 2 молекул пирувата, катализируемой пируватдегидрогеназным комплексом, являются 2 молекулы ацетил-КоА и НАД-H2. Окисление 2 молекул ацетил-КоА в ЦТК приводит к образованию 6 молекул НАД-H2 и по 2 молекулы ФАД-H2 и АТФ. Перенос каждой пары электронов с НАД-H2, если принять P/O равным 3, приводит к синтезу 30 молекул АТФ (2 молекулы НАД-H2 дает процесс гликолиза, 2 молекулы НАД-H2 — окислительное декарбоксилирование пирувата, 6 молекул НАД-H2 — ЦТК). Перенос каждой пары электронов с ФАД-H2 приводит к синтезу 2 молекул АТФ, т. е. при двух оборотах цикла это дает 4 молекулы АТФ. К этому следует прибавить 2 молекулы АТФ, образуемые в процессе гликолиза, и 2 молекулы АТФ, синтезируемые в ЦТК на этапе превращения сукцинил-КоА в янтарную кислоту. Итак, полное окисление 1 молекулы глюкозы в максимальном варианте приводит к образованию 38 молекул АТФ.

Для аэробных эубактерий характерна меньшая степень сопряжения электронного транспорта в дыхательной цепи с фосфорилированием, проявляющаяся в низком значении коэффициента Р/O. В опытах, проводившихся с использованием препаратов бактериальных мембран, это отношение в большинстве случаев не превышало 1. Невысокое значение Р/O связано с тем, что в бактериальных дыхательных цепях локализовано меньше генераторов DmH+, чем в митохондриальной дыхательной цепи. Нельзя также исключать и то обстоятельство, что в процессе получения препаратов бактериальных мембран нарушается их структурная целостность, а это приводит к резкому падению функциональной активности выделенных мембран. У Е. coil и Azotobacter vinelandii отношение P/O равно 2, у Corynebacterium diphteriae — 1, а у Mycobacterium phlei — 3. Это позволяет сделать вывод о том, что дыхательные цепи бактерий весьма существенно отличаются от аналогичной системы, функционирующей в эукариотных клетках. Они менее стабильны по составу и значительно менее энергетически эффективны.

Все эубактерий, имеющие развитую систему электронного транспорта, сопряженного с генерированием энергии, можно разделить на две большие группы в зависимости от источника энергии, т. е. природы донора электронов. К первой группе относятся организмы, использующие в качестве источника энергии процессы окисления неорганических соединений. Вторую группу составляют организмы, у которых донорами электронов служат различные органические соединения.

Таблица 29. Типы анаэробного дыхания у эубактерий*

* Описаны анаэробные бактерии, способные окислять органические соединения, используя в качестве конечного акцептора электронов Fe3+ или Mn4+.

Вместо O2 некоторые эубактерий могут в качестве конечного акцептора электронов использовать ряд окисленных органических или неорганических соединений (табл. 29). Этот процесс получил название анаэробного дыхания. Освобождаемая энергия и состав переносчиков определяются окислительно-восстановительными потенциалами акцепторов электронов. Анаэробные дыхательные цепи содержат те же типы переносчиков, что и аэробные, но цитохромоксидазы заменены соответствующими редуктазами. Иные, нежели O2, акцепторы электронов могут использоваться в этом качестве только в отсутствие молекулярного кислорода в среде или же последний вообще не может служить акцептором электронов. В зависимости от этого эубактерий, осуществляющие анаэробное дыхание, относятся к факультативным или облигатным анаэробам. Донорами электронов у них могут служить органические или неорганические соединения.

Группы хемолитотрофных эубактерий

Эубактерий, у которых источником энергии служат процессы окисления неорганических соединений, были обнаружены в конце XIX в. и их открытие связано с именем С. Н. Виноградского. В качестве источников энергии хемолитотрофы могут использовать довольно широкий круг неорганических соединений, окисляя их при дыхании (табл. 30). Дыхательные цепи хемолитотрофов содержат те же типы переносчиков, что и хемоорганотрофов. Разнообразие наблюдается только на периферических участках энергетического метаболизма, так как для окисления неорганических соединений, связанного с получением энергии, необходимы соответствующие ферментные системы. Например, у Thiobacillus ferrooxidans, получающего энергию в результате окисления двухвалентного железа, дыхательная цепь дополнена медьсодержащим белком рустицианином, непосредственно акцептирующим электроны с Fe2+.

Таблица 30. Группы хемолитотрофных эубактерий*

* Описана автотрофная бактерия Stibiobacter senarmontii, источником энергии для которой служит окисление трехвалентной сурьмы до пятивалентной.

** Если акцептор электронов O2, одним из конечных продуктов является вода.

*** У отдельных представителей. Используемые в качестве доноров электронов неорганические соединения различаются окислительно-восстановительными потенциалами. Это определяет место включения в дыхательную цепь электронов окисляемого субстрата. При окислении H2 водородными бактериями электроны с субстрата включаются в дыхательную цепь на уровне НАД+, при окислении Fe2+ железобактериями — на уровне цитохрома c, а при окислении NO2 – нитрификаторами — на уровне цитохрома a, (рис. 97). В целом окисление эубактериями неорганических соединений (за исключением H2) сопряжено с переносом электронов на цитохромы. С этим связаны важные последствия. Включение электронов с субстрата на уровне цитохромов приводит к тому, что во-первых, в электронтранспортной цепи функционирует только один генератор DmH+, поэтому для обеспечения энергией организму необходимо "переработать" большое количество энергетического субстрата; во-вторых, в этом процессе не образуется восстановитель НАД-H2, необходимый для биосинтетических процессов. Потребность в НАД-H2 особенно высока, если источником углерода служит CO2.

Природа остроумно решила эту проблему ценой дополнительных энергетических затрат: в тех случаях, когда место включения электронов с окисляемого субстрата находится ниже энергетического уровня, на котором образуется НАД-H2, работает система обратного переноса электронов, т. е. "лифт", поднимающий электроны по дыхательной цепочке в сторону более отрицательного потенциала, необходимого для восстановления молекул НАД+. Процесс обратного транспорта электронов требует энергии, и часть молекул АТФ, получаемых за счет окислительного фосфорилирования на конечном этапе дыхательной цепи, тратится для образования восстановителя. Окисление соединений с положительным окислительно-восстановительным потенциалом происходит, таким образом, без участия флавопротеинов и хинонов. Эти переносчики функционируют только в процессе обратного переноса электронов. Следовательно, у таких эубактерий дыхательная цепь работает в двух направлениях: осуществляет транспорт электронов для получения энергии в соответствии с термодинамическим потенциалом и перенос электронов против термодинамического потенциала, идущий с затратой энергии, чтобы синтезировать восстановитель (рис. 97).

Все это создает большую нагрузку на конечный этап дыхательной цепи. Действительно, у железобактерий и нитрификаторов конечный участок дыхательной цепи развит очень сильно: эти бактерии характеризуются исключительно высоким содержанием цитохромов с и а, во много раз превышающим их содержание у гетеротрофов. Рассмотрим теперь более подробно отдельные группы хемолитотрофных эубактерий.

Эубактерии, окисляющие соединения серы Описано много представителей разных групп эубактерий, способных окислять восстановленные соединения серы, например, сероводород, тиосульфат, а также молекулярную серу. Это фототрофы, осуществляющие бескислородный фотосинтез, некоторые типичные гетеротрофные бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter и других и группы бесцветных серобактерий и тионовых бактерий. Окисление серы и ее восстановленных соединений может служить источником клеточной энергии, электронов при фотосинтезе, использоваться для детоксикации образующейся при дыхании перекиси водорода.

Тионовые бактерии. Использование процесса окисления серы и ее неорганических восстановленных соединений для получения клеточной энергии показано для группы тионовых бактерий, представленных родами Thiobacillus, Thiomicrospira, Thiodendron и др. Это одноклеточные организмы разной морфологии и размеров; неподвижные или подвижные (движение осуществляется с помощью полярно расположенных жгутиков); бесспоровые. Размножаются делением или почкованием. Имеют клеточную стенку грамотрицательного типа. Для некоторых представителей рода Thiobacillus характерна развитая система внутрицитоплазматических мембран.

Для тионовых бактерий показана способность окислять с получением энергии помимо молекулярной серы (S0) многие ее минеральные восстановленные соединения: сульфид (S2 – ), тиосульфат (S2O32 – ) сульфит (SO32 – ), тритионат (S3O62 – ), тетратионат (S4O62 – ). Некоторые тионовые бактерии могут получать энергию за счет окисления тиоцианата (CNS – ), диметилсульфида (CH3SCH3), диметилдисульфида (CH3SSCH3), а также сульфидов тяжелых металлов. Там, где в качестве промежуточного продукта окисления образуется молекулярная сера, она откладывается вне клетки. Thiobacillus ferrooxidans получает энергию, окисляя также двухвалентное железо.

Полное ферментативное окисление тионовыми бактериями молекулярной серы и различных ее восстановленных соединений приводит к образованию сульфата. Окисление сероводорода до сульфата сопровождается потерей 8 электронов, поступающих в дыхательную цепь, при этом в качестве промежуточных продуктов образуется молекулярная сера и сульфит:

H2S ® S0 ® SO32– ® SO42– На этапе окисления сульфита до сульфата, протекающего с образованием аденилированного промежуточного соединения аденозинфосфосульфата (АФС), имеет место субстратное фосфорилирование, позволяющее запасать освобождающуюся при этом энергию в молекулах АТФ:

SO32 – + АМФ ® АФС + 2e–; АФС + ФН ® SO42 – + АДФ; Далее с помощью аденилаткиназы из АДФ синтезируется АТФ:

2АДФ ® АМФ + АТФ.

Основное же количество энергии тионовые бактерии получают в результате переноса образующихся при окислении восстановленной серы электронов, поступающих в дыхательную цепь на уровне цитохрома c (рис. 97). Дыхательная цепь тионовых бактерий содержит все типы переносчиков, характерных для аэробных хемогетеротрофов. У тионовых бактерий обнаружены флавопротеины, убихиноны, FeS-белки, цитохромы типа b, c, цитохромоксидазы o, d, a + a3.

В большинстве случаев конечным акцептором электронов служит O2, который не может быть заменен никаким другим акцептором. Рост отдельных штаммов возможен в микроаэробных условиях. Некоторые тионовые бактерии являются факультативными аэробами; они могут использовать в качестве конечного акцептора электронов не только O2, но и нитраты, восстанавливая их до N2 или только до нитрита. В анаэробных условиях использование нитратов в качестве конечного акцептора электронов индуцирует синтез диссимиляционной нитратредуктазы, осуществляющей перенос электронов дыхательной цепи на нитраты.

Некоторые виды относятся к облигатным хемолитоавтотрофам, другие — могут расти как хемолитоавтотрофно, так и хемоорганогетеротрофно, используя в последнем случае в качестве источника углерода и энергии ряд органических соединений (кислоты, сахара, спирты, аминокислоты). Наконец, описаны тионовые бактерии, растущие хемолитогетеротрофно, используя в качестве источника углерода только органические соединения, а энергию получая за счет окисления восстановленных соединений серы. Основным механизмом ассимиляции CO2 служит восстановительный пентозофосфатный цикл, обнаруженный у всех тионовых бактерий. Вспомогательную роль играют реакции карбоксилирования трехуглеродных соединений, в первую очередь фосфоенолпировиноградной кислоты.

Поскольку у тионовых бактерий место включения электронов в дыхательную цепь находится на уровне цитохрома c, у них функционирует система обратного переноса электронов для обеспечения конструктивных процессов молекулами НАДxH2.

У разных представителей этой группы, способных расти, используя органические соединения, обнаружены активности ферментов гликолиза, окислительного пентозофосфатного пути, пути Энтнера — Дудорова. Описано функционирование "замкнутого" и "разорванного" ЦТК, а у некоторых тиобацилл — глиоксилатного шунта.

Тионовые бактерии приспособлены к разным условиям обитания. Thiobacillus thiooxidans и Т. ferrooxidans — ярко выраженные ацидофилы (оптимальный pH 2–4), Т. denitrificans и Т. thioparus, наоборот, развиваются только в нейтральной и щелочной среде (pH 7–10). Большинство тиобацилл относятся к мезофилам с оптимальной температурой роста приблизительно 30°. В последнее время описаны термофильные штаммы, растущие при 60–70°.

Бесцветные серобактерии очень напоминают цианобактерии, являясь как бы их непигментированными аналогами. H2 основании морфологических признаков делятся на две группы: одна представлена одноклеточными формами (роды Achromatium, Macromonas и др.), в составе другой объединены нитчатые организмы (роды Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca). Одноклеточные бесцветные серобактерии — подвижные или неподвижные, различающиеся размерами формы. Нитчатые организмы представлены также неподвижными или способными к скользящему движению видами (см. рис. 45, 1).

Единственный общий признак группы — способность откладывать серу в периплазматическом пространстве клеток. Вопрос о значении, которое имеет окисление восстановленных соединений серы для этой группы бактерий, имеет длинную историю. С. Н. Виноградский, наблюдая в 1887–1889 гг. в клетках Beggiatoa при выращивании на среде с H2S отложение гранул серы и их последующее исчезновение после исчерпания сероводорода из среды, пришел к выводу, что энергия, освобождающаяся при окислении H2S до S0 и затем до SO42 – c участием O2, используется этим организмом для ассимиляции CO2. Таким образом, работая с Beggiatoa, С. Н. Виноградский сформулировал положение о принципиально новом способе существования организмов — хемолитоавтотрофии. Однако позднее выяснилось, что культуры, с которыми работал С. Н. Виноградский, были нечистыми. И до сих пор большинство представителей этой группы не выделены в виде чистых культур, что затрудняет изучение их физиологии. Для некоторых бесцветных серобактерий, в том числе и для Beggiatoa, были получены данные в пользу того, что окисление H2S может быть связано с получением клеткой энергии.

В то же время показано, что важная физиологическая особенность бесцветных серобактерий — образование ими значительных количеств перекиси водорода. Более 80 — 90% потребленного клетками в процессе дыхания O2 восстанавливается лишь до H2O2. Накоплению в клетках перекиси водорода способствует низкая каталазная активность, обнаруженная у этих организмов. Была выявлена определенная связь между окислением H2S и кислородным метаболизмом бесцветных серобактерий. Оказалось, что окисление соединений серы используется этими организмами для удаления H2O2. Отложение молекулярной серы является, таким образом, результатом окисления сульфидов среды перекисью водорода, образующейся в клетке. Перекисный механизм окисления восстановленных соединений серы исключает возможность использования организмами энергии этого процесса.