Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

Нитрогеназная система, катализирующая фиксацию молекулярного азота, как известно, состоит из двух металлопротеинов: белка, содержащего железо и молибден, и белка, в состав которого входит только железо. Каждый белок необходим для проявления каталитической активности. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O2 Fe-белок.

Чувствительность белков нитрогеназы к O2 определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O2 по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы.

Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O2. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Гидрогеназы многих прокариот также обнаруживают высокую чувствительность к молекулярному кислороду, которая in vitro в большой мере зависит от метода выделения и степени очистки. Как правило, более устойчивы к O2 неочищенные ферментные препараты. По сравнению с мембрансвязанным ферментом устойчивость к O2 гидрогеназы, отделенной от мембраны, обычно ниже. Фермент, полученный из клеток анаэробов, более чувствителен к O2, чем выделенный из клеток аэробных прокариот.

Каталитическая активность рибулозодифосфаткарбоксилазы, фермента, катализирующего фиксацию CO2 у подавляющего большинства автотрофных прокариот, зависит ст парциальных давлений СO2 и O2. При высокой концентрации O2 и низкой — CO2 преобладает оксигеназная реакция:

Молекулы O2 и СO2 конкурируют за каталитический центр фермента. И хотя сам фермент не обнаруживает повышенной чувствительности к молекулярному кислороду и, следовательно, не повреждается при его высокой концентрации, увеличение O2 в среде приводит к изменению функционирования рибулозодифосфаткарбоксилазы. Протекание ферментативной реакции по оксигеназному пути приводит к истощению клеточного пула молекул рибулозодифосфата и, как следствие этого, понижению активности восстановительного пентозофосфатного цикла в клетке.

Помимо существования в основной форме в биологических реакциях и под действием различных физико-химических факторов возникают продукты неполного восстановления O2, более реакционно способные и обладающие высокой токсичностью для клетки. Как известно, для полного восстановления молекулярного кислорода, приводящего к образованию молекулы воды, требуются 4 электрона:

O2 + 4H+ + 4e– ® 2H2O У большинства прокариот имеются ферменты, катализирующие реакции одновременного переноса 4 электронов на O2, при которых не обнаружено каких-либо промежуточных продуктов восстановления O2. Это цитохромоксидазы и некоторые медьсодержащие ферменты. Возможно, что в этих реакциях и возникают короткоживущие продукты неполного восстановления O2, но они остаются связанными с ферментами, не выходят в цитоплазму и практически не наносят вреда клетке.

Супероксидный анион. Если восстановление молекулярного кислорода происходит ступенчато, то при переносе 1 электрона на O2 образуется надпероксидный (супероксидный) анион:

O2 + e– ® O2–.

Последний содержит неспаренный электрон, поэтому является отрицательно заряженным радикалом (анион-радикалом). Он может протонироваться с образованием нейтрального гидропероксидного радикала:

O2–. + H+ ® HO2.

В последнее время признание получила точка зрения, согласно которой основную опасность для организмов представляют продукты, образующиеся при одноэлектронном восстановлении молекулы O2, одним из которых является супероксидный анион.

Можно назвать много биохимических реакций, приводящих к его возникновению. Супероксидные анионы генерируются при взаимодействии с молекулами O2 различных компонентов (восстановленные флавины, хиноны, тиолы, FeS-белки), а также в реакциях, катализируемых рядом флавопротеиновых ферментов. Наконец, в процессе фотосинтеза имеет место поток электронов. Большинство реакций фотосинтеза — это реакции одноэлектронного переноса. Поэтому в системе часто возникают супероксидные анионы. Помимо реакций биологической природы O2–. могут возникать вне клетки в водных растворах при воздействии на них ультразвуком, в результате фотохимических, химических и электрохимических процессов.

Опасность любых реакционно активных соединений в значительной степени зависит от их стабильности. В этом плане ионы O2–. весьма опасны, так как время их "жизни" в водной среде продолжительнее, чем у остальных O2-производных радикалов. Поэтому экзогенно возникшие O2–. могут проникать в клетку и (наряду с эндогенными) участвовать в реакциях, приводящих к различным повреждениям: перекисном окислении ненасыщенных жирных кислот, окислении SH-групп белков, повреждении ДНК и др. Токсичность супероксидных анионов может увеличиваться за счет вторичных реакций, ведущих к образованию гидроксидных радикалов (OH.) и синглетного кислорода (*O2).

Многие прокариоты, относящиеся к разным физиологическим группам, в том числе и строго анаэробные виды, имеют специфическую защиту в виде фермента супероксиддисмутазы, осуществляющего перехват ионов O2–. и катализирующего их дисмутацию. Образующиеся супероксидные анионы дисмутируют в реакции, протекающей спонтанно (3) или катализируемой супероксиддисмутазой (4):

O2–. + O2–. + 2H+ ® H2O2 + *O2;     (3) O2–. + O2–. + 2H+ ® H2O2 + O2.     (4) Различия между обеими реакциями в их скоростях (скорость ферментативной реакции приблизительно на четыре порядка выше, чем спонтанной), а также в том, что при спонтанной реакции дисмутации одним из первоначально возникающих продуктов является синглетный кислород, в то время как при ферментативной реакции образующийся кислород находится в основном триплетном состоянии.

Гидроксидный радикал. Супероксиданион может взаимодействовать с H2O2 с образованием гидроксидного радикала (OH.), превосходящего O2–. по окислительной активности и токсичности:

O2–. + H2O2 + H+ ® O2 + H2O + OH..     (5) Источником возникновения ОН. могут служить реакции одноэлектронного окисления перекиси водорода, катализируемые железосодержащими соединениями, всегда имеющимися в клетках:

H2O2 + Fe2+ ® Fe3+ + OH– + OH..     (6) Помимо указанных выше реакций гидроксидные радикалы образуются также при радиолизе воды и в низких концентрациях обычно присутствуют в водных растворах. OH. из всех известных окислителей является самым сильным, вызывающим радиационные повреждения многих типов биополимеров.

Перекись водорода. Перенос 2 электронов на O2 приводит к образованию перекисного аниона (7) или перекиси водорода (8):

O2 + 2e– ® O22–;     (7) O2 + 2H+ + 2e– ® H2O2.     (8) Катализировать перенос 2 электронов на O2 могут содержащиеся в клетках прокариот оксидазы флавиновой природы и некоторые цитохромы. Источником H2O2 могут быть реакции автоокисления некоторых негемовых FeS-белков, а также описанные выше реакции дисмутации супероксидных радикалов (реакции 3 и 4). Перекись водорода образуется у всех аэробов и факультативных анаэробов, растущих в аэробных условиях, так что ее возникновение в клетках прокариот — естественный процесс.

Перекись водорода — наиболее стабильный из промежуточных продуктов восстановления O2, но и наименее реакционноспособный. У большинства аэробных прокариот H2O2 быстро разлагается с помощью гемсодержащих ферментов каталазы и пероксидазы. В отсутствие их H2O2 может накапливаться в летальных для организма концентрациях.

H2O2 вызывает окисление SH-групп в белках, перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот. Однако эти реакции протекают с измеримыми скоростями, если концентрация H2O2 в клетке будет на четыре порядка выше той, которая обычно достигается in vivo. Поэтому не исключено, что перекись водорода опасна не из-за прямого взаимодействия с компонентами клетки, а потому, что, реагируя с O2–. (реакция 5) или ионами Fe2+ (реакция 6), может приводить к образованию гидроксидного радикала.

В 20-х гг. большой популярностью пользовалась теория, объясняющая токсичность O2 накоплением в клетке перекиси водорода. Однако позднее были обнаружены более токсичные для клетки формы O2 среди первичных и вторичных продуктов его одноэлектронного восстановления (O2, OH., *O2).

Синглетный кислород. В норме O2 находится в стабильном состоянии, называемом триплетным и характеризующемся наименьшим уровнем молекулярной энергии. В определенных условиях молекула O2 переходит в одно из двух возбужденных синглетных состояний (*O2), различающихся степенью энергизованности и длительностью "жизни". У большинства живых клеток в темноте основным источником синглетного кислорода служит спонтанная дисмутация супероксидных анионов (см. реакцию 3). Синглетный кислород может возникать также при взаимодействии двух радикалов:

O2–. + OH. ® OH– + *O2.    (9) Вероятно, любая биологическая система, в которой образуется O2, может быть активным источником синглетного кислорода. Однако последний возникает и в темновых ферментативных реакциях в отсутствие O2 .

Давно было известно, что на свету токсичность молекулярного кислорода для живых организмов повышается. Этому способствуют находящиеся в клетке вещества, поглощающие видимый свет, — фотосенсибилизаторы 63 Многие природные пигменты могут быть фотосенсибилизаторами. В клетках фотосинтезирующих организмов активными фотосенсибилизаторами являются хлорофиллы и фикобилипротеины. Окисление биологически важных молекул под влиянием видимого света в присутствии молекулярного кислорода и фотосенсибилизатора получило название фотодинамического эффекта.

63 Фотосенсибилизаторы — молекулы, способные поглощать свет и индуцировать химические реакции, которые в их отсутствие не происходят. Способность поглощать свет обусловлена наличием в молекулах хромофорных группировок, содержащих обычно циклические ядра. Известно более 400 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов. Среди природных веществ фотосенсибилизаторами являются хлорофиллы, фикобилины, порфирины и промежуточные продукты их синтеза, ряд антибиотиков, хинин, рибофлавин и др. Некоторые фотосенсибилизаторы действуют только в присутствии O2, вызывая фотодинамический эффект.

Поглощение видимого света приводит к переходу молекулы фотосенсибилизатора в возбужденное синглетное состояние (*Д):

Д+hn ® *Д Молекулы, перешедшие в синглетное состояние, могут возвращаться в основное (Д) или переходить в долгоживущее триплетное состояние (*Д), в котором они фотодинамически активны. Установлено несколько механизмов, с помощью которых возбужденная молекула (*Д) может вызывать окисление молекулы субстрата. Один из них связан с образованием синглетного кислорода. Молекула фотосенсибилизатора в триплетном состоянии реагирует с O2 и переводит его в возбужденное синглетное состояние:

TД + O2 ® Д + *O2.

Синглетный кислород окисляет молекулу субстрата (В):

B +*O2 ® ВO2.

Фотодинамический эффект обнаружен у всех живых организмов. У прокариот в результате фотодинамического действия индуцируются повреждения многих типов: утрата способности формировать колонии, повреждение ДНК, белков, клеточной мембраны. Причина повреждений — фотоокисление некоторых аминокислот (метионина, гистидина, триптофана и др.), нуклеозидов, липидов, полисахаридов и других клеточных компонентов.

Клетки содержат вещества, выполняющие функцию тушения синглетного кислорода и понижающие возможность структурных и иных повреждений, вызываемых им. Одним из "тушителей" синглетного кислорода служат каротиноиды, защищающие фотосинтезирующие организмы от летальных эффектов, фотосенсибилизируемых хлорофиллом. Перехватчиками *O2 являются также различные биологически активные соединения: липиды, аминокислоты, нуклеотиды, токоферолы и др.

Озон и атомарный кислород. Продуктами молекулярного кислорода являются также атомарный кислород (O) и озон (O3). Известно, что молекулярный кислород сильно поглощает свет в дальней УФ-области (160–240 нм). Поглощенный фотон вызывает диссоциацию молекулы кислорода на два атома:

O2 +hn ® 2O.

Затем спонтанно протекает реакция, приводящая к образованию молекулы озона:

O2 + O ® O3 Озон может возникать из молекулярного кислорода в воздухе при сильных электрических разрядах, а также при электролизе воды и в некоторых реакциях, где он сопровождает образование O2. В некоторых реакциях окисления с помощью озона образуется синглетный кислород. Как окислители озон и атомарный кислород сильнее O2. Озон может реагировать практически со всеми типами соединений с образованием радикалов.

Защитные механизмы клетки

Для нейтрализации токсических форм O2 существующие прокариоты выработали различные защитные механизмы, которые могут быть разделены на несколько типов. В основе систем защиты первого типа лежит активность специальных ферментов, для которых разложение токсических форм O2 является основной и в ряде случаев единственной функцией. В системах защиты второго типа для разрушения токсических форм O2 используются определенные клеточные метаболиты. Как правило, в этом случае участие в защите клетки от токсических эффектов производных O2 является не единственной функцией этих метаболитов. Наконец, к защитным механизмам особого типа может быть отнесен ряд приспособлений, выработанных прокариотами на разных уровнях: популяционном, физиологическом, структурном. Более вероятно, что они были созданы для других целей, но оказались полезными и для детоксикации O2.

Ферментные системы защиты. Передовой линией защиты от токсического действия производных O2 являются ферменты: супероксиддисмутаза, захватывающая молекулы О2 (реакция 4), каталаза и пероксидаза, улавливающие H2O2:

Они сводят до минимума концентрацию в клетке O2–. и H2O2 и не дают им возможности взаимодействовать с образованием ОН. (реакция 5).

Супероксиддисмутаза обнаружена у хемотрофных прокариот, использующих O2 (облигатно и факультативно аэробных форм), а также у изученных представителей из групп фотосинтезирующих прокариот. Среди анаэробов фермент найден у подавляющего большинства аэротолерантных форм. Исключение составляют некоторые молочнокислые бактерии, однако в клетках большинства из них содержатся высокие концентрации (до 30 мМ) ионов двухвалентного марганца. Оказалось, что Мп2+, для которого показана способность окисляться под действием O2, в таких концентрациях способен так же эффективно убирать образующиеся супероксидные ионы, как это делает супероксиддисмутаза, содержание которой в клетке обычно поддерживается на микромолярном уровне. Таким образом, у этих молочнокислых бактерий функцию нейтрализации O2 выполняют ионы Mn2+.

В клетках некоторых видов молочнокислых бактерий не найдено ни супероксиддисмутазы, ни высоких концентраций Mn2+. Эти виды характеризуются очень высокой чувствительностью к O2.

Среди облигатных анаэробов супероксиддисмутаза обнаружена у многих представителей рода Clostridium. Изучение их устойчивости к O2 обнаруживает четкую связь с содержанием в клетках этого фермента. Виды, имеющие супероксиддисмутазу, характеризуются умеренной или даже высокой устойчивостью к O2 по сравнению с видами, у которых этот фермент отсутствует. Супероксиддисмутаза найдена у разных видов строго анаэробных бактерий. Число организмов с не выявленной до сих пор супероксиддисмутазой очень мало.

Обнаружение супероксиддисмутазы у строгих анаэробов (гораздо более распространенное, чем предполагали раньше) ставит вопрос о ее физиологической роли у этих организмов. Способность последних расти только в бескислородной среде делает неясным функции фермента в данных условиях. Возможно, что только при попадании строгого анаэроба в неблагоприятные для него аэробные условия синтез фермента индуцируется молекулярным кислородом, что и обеспечивает организму защиту от O2 в этих условиях.

Супероксиддисмутаза — фермент, содержащий в активном центре в качестве простетической группы ионы металла. У прокариот — это атомы марганца и/или железа. Большинство изученных супероксиддисмутаз построено из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит по одному атому металла. Fe- и Mn-ферменты сходны по аминокислотной последовательности. Попытки выявить связь между физиологическими и иными особенностями организмов и металлоформой содержащегося в них фермента не привели к определенному заключению. И та и другая формы супероксиддисмутазы обнаружены у представителей грамположительных и грамотрицательных прокариот, среди фото- и хемотрофов, облигатных анаэробов, аэробов и факультативно анаэробных форм. Более того, обе металлоформы супероксиддисмутазы могут присутствовать у одного организма и даже входить в состав молекулы одного фермента. Для некоторых видов показано, что синтез того или иного типа фермента зависит от наличия ионов металла в среде культивирования.

Супероксиддисмутаза изученных хемотрофных прокариот — не связанный с мембранами фермент, локализованный в цитоплазме. У Е. coli, в клетках которой обнаружены Fe-, Mn- и Fe/Mn-формы фермента, Fe-супероксиддисмутаза локализована в периплазматическом пространстве, а Mn-содержащий фермент — в цитоплазме. В связи с этим высказывается предположение, что металлоформы фермента играют разную роль в защите клетки от O2–.: Fe-содержащий фермент защищает клетку от экзогенных супероксидных анионов, а Mn-содержащий — от эндогенных.

Особо остро стоит проблема защиты от молекулярного кислорода и его производных в клетках цианобактерий. Вероятно, именно они впервые в наибольшей степени ощутили последствия токсических эффектов кислорода. Супероксиддисмутаза найдена у всех цианобактерий. В клетках Anacystis nidulans (Synechococcus) Fe-супероксиддисмутаза, составляющая до 90% от общего количества фермента, локализована в цитозоле клетки, а Mn-содержащая форма — в тилакоидах. Функция последней формы фермента сводится, вероятно, к перехвату ионов O2–., возникающих в процессе фотосинтетического электронного транспорта.

Каталаза и пероксидаза. Перекись водорода разрушается двумя классами родственных ферментов, катализирующих ее двухэлектронное восстановление до H2O и использующих в качестве донора электронов H2O2 в случае каталазы (реакция 10) или различные органические соединения в случае пероксидазы (реакция 11).

Каталазная и пероксидазная активности обнаружены у всех облигатно и факультативно аэробных прокариот. Среди облигатных анаэробов эти ферменты распространены значительно в меньшей степени, чем супероксиддисмутаза. Обнаружены многие строгие и аэротолерантные анаэробы, содержащие супероксиддисмутазу, но не содержащие каталазы. К их числу можно отнести и те молочнокислые бактерии, у которых дисмутация образующихся ионов O2–. обеспечивается Mn2+, находящимся в клетках в высоких концентрациях.

Отсутствие каталазы у молочнокислых бактерий связано с тем, что они не могут синтезировать гем — простетическую группу фермента, но способны к синтезу апофермента. При добавлении гемовых групп извне молочнокислые бактерии образуют гемсодержащую каталазу. У ряда молочнокислых бактерий обнаружена каталаза, не содержащая гемовой группы, названная поэтому псевдокаталазой. Выделенный фермент состоит из шести идентичных полипептидных цепей, соединенных между собой нековалентными силами. Каждая субъединица содержит 1 атом марганца.

Перекись водорода, возникающая в результате взаимодействия клеток с O2, устраняется и неферментативными путями. Известно, что ионы Fe2+ в водном растворе ускоряют восстановление H2O2 до H2O. В клетке всегда содержится некоторое количество ионов железа. Разрушение H2O2 может происходить и за счет выделяющихся в культуральную среду восстановленных веществ.

Для анаэробных прокариот, способных переносить контакт с O2 и его производными в относительно небольших масштабах, необходимо присутствие в клетках супероксиддисмутазы, "убирающей" O2–.. Наличие каталазы при этом не обязательно, поскольку возникающая в реакции дисмутации и других реакциях перекись водорода разлагается спонтанно или с участием неферментативных катализаторов, и организмы в целом справляются с ней в этих условиях. Таким образом, при осуществлении энергетического метаболизма анаэробного типа для устранения токсических эффектов O2. достаточно одной ферментной преграды в виде супероксиддисмутазы.