MedBookAide - путеводитель в мире медицинской литературы
Разделы сайта
Поиск
Контакты
Консультации

Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
<<< НазадСодержаниеДальше >>>

Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути, объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции и регуляции — оперон. Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координирование регулируются одним репрессором. Оперон представляет собой весьма рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.

Рис. 32. Триптофановый оперон Е. coli и механизм репрессии конечным продуктом. А — продукт гена-регулятора (R) — неактивная форма репрессора, неспособная связываться с оператором (О); промоторный участок (Р) открыт: происходит транскрипция структурных генов (Е, D, С, В, А). Б — в присутствии корепрессора образуется активный комплекс корепрессор — репрессор, связывающийся с оператором и закрывающий промотор; транскрипции не происходит (по Lehninger, 1974)  

Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы, катализирующей синтез иРНК, к определенному участку ДНК, называемому промотором (Р). Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок, она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНК-полимеразы и началу транскрипции. У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют оперон (рис. 32). Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического белка — триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии. Последний в таком виде не связывается с операторным участком и, следовательно, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конечный продукт метаболического пути (триптофан) накапливается выше определенного уровня, он взаимодействует с репрессором и активирует его.

Активированный репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию триптофанового оперона. Таким образом, триптофан является корепрессором.

Индукция синтеза ферментов. В большинстве случаев регуляция путем индукции характерна для катаболических путей, где в качестве индукторов выступают обычно субстраты этих путей. Классический пример индуцибельного фермента — (3-галактозидаза Е. coli. Оказалось, что если клетки Е. coli выращивать в среде, содержащей глюкозу, то они не могут использовать лактозу. Если такие клетки поместить в среду, где лактоза — единственный источник углерода, после некоторого периода в них происходит интенсивный синтез фермента (3-галактозидазы, катализирующего гидролиз лактозы на D-глюкозу и D-галактозу. С помощью этого фермента Е. coli может теперь использовать лактозу в качестве единственного источника углерода. Если затем клетки, растущие на среде с лактозой, перенести на среду с глюкозой, синтез (3-галактозидазы прекращается.

Изучение индукции (3-галактозидазы у Е. coli позволило установить, что рост клеток на среде с лактозой происходит не в результате отбора мутантов, у которых способность использовать лактозу есть следствие мутации. Способностью синтезировать этот фермент обладают все клетки. Было также показано, что в процессе индукции происходит не активирование уже имеющегося в клетках фермента (З-галактозидазы, а его синтез de novo из аминокислот.

Индуцированный синтез ферментов у микроорганизмов был описан в 30-х гг., но механизм этого процесса долгое время оставался непонятен. Индуцированный синтез ферментов лежит в основе широко известного явления адаптации организмов к различным условиям. Успехи, достигнутые в расшифровке механизмов регуляции клеточного метаболизма, позволили объяснить природу этого явления, его механизм и роль в клетке.

Лактозный оперон Е. coli, состоящий из трех структурных генов, промотора и оператора, был первой ферментной системой, на которой Ж. Моно и Ф. Жакоб изучали механизм индукции синтеза ферментов (рис. 33). В отсутствие лактозы молекула репрессора, активная в свободном состоянии, связывается с оператором и подавляет транскрипцию структурных генов. Когда в клетку попадает лактоза, она связывается с репрессором, в результате образуется неактивный комплекс репрессора с индуктором, который не может взаимодействовать с оператором и, следовательно, препятствовать транскрипции структурных генов. В результате индуцируется синтез ферментов катаболизма лактозы. При удалении из клетки индуктора репрессор снова переходит в активное свободное состояние, связывается с оператором, что приводит к прекращению синтеза соответствующих ферментов.

Катаболитная репрессия. Кроме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии. Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются.

Рис. 33. Индукция синтеза ферментов катаболизма лактозы у Е. coli. А — ген-регулятор (R) образует репрессорный белок, связывающийся с оператором (О) и закрывающий промотор (Р); транскрипции структурных генов (z, у, а) не происходит; Б — в присутствии индуктора образуется неактивный репрессор, теряющий способность связываться с оператором; промотор открыт, происходит транскрипция  

Выше уже отмечалось, что если в среде для выращивания Е. coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза, сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона, ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.

Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем циклического АМФ (цАМФ), который в этом процессе функционирует в качестве эффектора. Он образует комплекс с аллостерическим белком — катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс, присоединившись к определенному участку на промоторе, обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию транскрипции. Количество образующегося комплекса определяется концентрацией цАМФ, которая уменьшается при увеличении содержания глюкозы в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его единственная функция — регуляторная. Циклический АМФ образуется из АТФ в реакции, катализируемой аденилатциклазой, связанной с ЦПМ:

АТФ ® цАМФ + пирофосфат.

Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом, активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию цАМФ в клетке. Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ и наоборот.

Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.

Регуляция различных метаболических путей

Биосинтетические пути регулируются преимущественно по механизму аллостерического ингибирования первого фермента и репрессии синтеза ферментов этого пути конечным продуктом. Регулирование разветвленных биосинтетических путей осуществляется с помощью усложненных вариантов этих же механизмов.

Основные механизмы, регулирующие катаболические пути, — индукция синтеза ферментов и катаболитная репрессия. Катаболические пути, в которых функционируют конститутивные ферменты, регулируются большей частью посредством аллостерических воздействий на активность ферментов. Одна из задач катаболических путей — обеспечение клетки энергией. У большинства прокариот возможности генерации энергии намного превышает потребности в ней клетки. Количество АТФ, которое можно синтезировать с помощью имеющихся в клетках аэробных прокариот ферментов гликолитического и дыхательного путей, значительно больше количества АТФ, необходимого для процессов биосинтеза и поддержания жизнедеятельности. Поэтому клетки должны обладать способностью контролировать потребление энергодающих субстратов и, следовательно, выработку клеточной энергии. Основной принцип контроля прост: АТФ синтезируется только тогда, когда он необходим, Иными словами, интенсивность энергетических процессов у прокариот регулируется внутриклеточным содержанием АТФ.

Адениловые нуклеотиды относятся к числу важнейших эффекторов. АМФ и АДФ действуют как положительные эффекторы, стимулирующие скорость энергетических процессов и, следовательно, повышающие выход АТФ. Наоборот, АТФ служит отрицательным эффектором, сигнализирующим о превышении процессов образования АТФ над его потреблением. В результате регуляции процессов синтеза и распада АТФ в клетке поддерживается стационарное энергетическое состояние, характеризующееся так называемым энергетическим зарядом клетки:

Величина энергетического заряда теоретически может колебаться от 1 (в клетке все адениловые нуклеотиды только в виде АТФ) до 0 (в клетке содержится только АМФ). В растущей культуре величина энергетического заряда клетки равна примерно 0,8. Уменьшение его свидетельствует об ухудшении энергообеспечения организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают.

Помимо адениловых нуклеотидов в регулировании энергетических процессов активную роль играют система НАД(Ф)+/НАД(Ф)-H2 коферментов и величина трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода в виде обоих его составляющих (DypH и DpH). Преобладание аллостерического взаимодействия восстановленной или окисленной форм НАД(Ф) с ферментами катаболического пути приводит соответственно к понижению или повышению их активности. Достижение определенного порогового значения DmH+ на энергопреобразующей мембране служит определенным сигналом, тормозящим поступление ионов водорода против градиента.

Регуляция процессов активного транспорта, обеспечивающего поступление подавляющего большинства необходимых прокариотам веществ, происходит на уровне синтеза переносчика и его функционирования. Биосинтез белковых компонентов многих транспортных систем регулируется по типу индукции. Глюкоза, транспортная система которой у большинства прокариот конститутивна, подавляет образование транспортных систем других сахаров и ряда органических кислот путем катаболитной репрессии. Исключение составляют некоторые облигатно аэробные прокариоты, у которых транспорт органических кислот конститутивен, а индуцируемой является транспортная система глюкозы. Избыток субстрата в среде может репрессировать синтез соответствующей транспортной системы. Это особенно характерно для аминокислот. В этом случае регуляция транспорта координирована с регуляцией их последующего метаболизма. Обнаружена также регуляция транспорта по типу отрицательной обратной связи, когда субстрат, накопленный внутри клетки, подавляет собственный транспорт из внешней среды. Таким образом, процессы клеточного транспорта находятся под контролем тех же механизмов, что и внутриклеточные анаболические и катаболические процессы.

Получение мутантов с нарушениями в системе регуляции клеточного метаболизма, приводящими к сверхсинтезу определенных метаболитов, широко используется для получения аминокислот, витаминов, полисахаридов и других веществ, имеющих практическое значение.

Регуляция межклеточных взаимодействий

Прокариоты синтезируют вещества, регулирующие не внутриклеточный метаболизм, а межклеточные взаимодействия. Особенностями этих веществ, называемых ауторегуляторами, являются выделение их в окружающую среду, проявление биологической активности в очень низкой концентрации (10–9 — 10–12 M) и воздействие не на организмы иного вида, а на другие особи (клетки) того же вида. Эти вещества выделяются клетками прокариот в обычных условиях культивирования и обнаруживают строгую видо- или родоспецифичность.

Как правило, реакция, вызываемая ауторегулятором, связана с жизненным циклом прокариот. Так, стадия формирования плодовых тел в жизненном цикле миксобактерий (см. рис. 21) индуцируется ауторегулятором. веществом липидной природы, выделяемом вегетативными клетками. Клетки Myxococcus xanthus выделяют вещества, вызывающие споруляцию этого вида при их концентрации в среде порядка 10–10 M. У Streptococcus faecalis установлен половой процесс. В клетках-реципиентах синтезируются специфические ауторегуляторы (половые регуляторы, или феромоны), под воздействием которых клетки-доноры приобретают способность прилипать к реципиенту. В результате повышается вероятность образования пары донор — реципиент.

Vibrio fischeri — обычный светящийся симбионт рыб семейства Monocentudae. Синтезируемый им ауторегулятор стимулирует образование нескольких компонентов системы свечения. Эффект обнаруживается при концентрации ауторегулятора 10 нМ, что соответствует примерно 1–2 молекулам этого соединения на бактериальную клетку. Оптимальная концентрация порядка 200 нМ (приблизительно 40 молекул ауторегулятора на клетку).

Несколько видов ауторегуляторов, контролирующих синтез антибиотика и спорообразование, обнаружено у актиномицета Streptomyces griseus. Необычное циклическое соединение, индуцирующее образование спор, идентифицировано в клеточных выделениях цианобактерии Cylindrospermum licheniforme.

Таким образом, прокариотные организмы синтезируют химические вещества-сигналы, регулирующие различные процессы, связанные с межклеточными взаимодействиями в популяции одного вида или даже штамма. Место действия ауторегуляторов — клеточные ферменты. Примечательно, что большинство изученных регуляторов — вещества липидной природы. Это позволяет им легко диффундировать через клеточные мембраны без помощи специальных транспортных систем. Феромоны S. faecalis — пептиды, содержащие 8 аминокислотных остатков, единственная гидрофильная аминокислота, входящая в состав этих пептидов, — серин. Гидрофобный характер пептидных феромонов S. faecalis также указывает на возможный неспецифический механизм их переноса через клеточные мембраны.

Выявление нового класса веществ — регуляторов жизнедеятельности прокариот на межклеточном уровне — интересно тем, что позволяет рассматривать эти организмы не просто как популяцию разрозненных клеток, но указывает на существование более высокого уровня их организации.

Глава 9. Прокариоты и факторы внешней среды

Для прокариот как группы в целом характерна способность существовать в гораздо большем диапазоне условий внешней среды, чем для эукариотных организмов. Среди прокариот есть организмы, которые могут расти в подводных вулканических источниках (температура до 300°С), кислой (pH 1 и ниже) и щелочной (pH 11 и выше) среде, при давлении 1000 атм, высоких концентрациях тяжелых металлов, концентрации соли до 30%, высоких уровнях радиации. Обязательным условием для этого является наличие водной среды. Прокариоты растут при активности воды в диапазоне от 0,7 до 0,998 и не могут расти в аэрозолях и во льду22.

22 Активность воды (Aw) служит мерой ее доступности и определяется в соответствии со следующим уравнением:

где Р — давление пара раствора, Р0 — давление пара растворителя (чистой воды); n1 и n2 — число молей растворителя и растворенного вещества соответственно.

Отношение к молекулярному кислороду

Кислород широко распространен в природе, находясь как в связанном, так и свободном состоянии. В первом случае он входит в состав молекул воды, органических и неорганических. соединений. Во втором — присутствует в современной атмосфере в виде молекулярного кислорода (O2), объемная доля которого составляет 21%. Кислород является обязательным химическим компонентом любой клетки. Подавляющее большинство организмов удовлетворяет свои потребности в этом элементе, используя обе формы кислорода. При выращивании, Pseudomonas в присутствии 18O2 и H218O источником приблизительно 10% кислорода, входящего в состав клеточного материала, служил газообразный кислород, 50–60% клеточного кислорода происходило из воды. Остальной кислород в клетку поставляли органические и неорганические компоненты питательной среды (глюкоза, фосфаты, нитраты, сульфаты и др.).

Рис. 34. Группы прокариот в замисимости от отношения к молекулярному кислороду  

Среди прокариот существуют значительные различия в отношении к молекулярному кислороду. По этому признаку они могут быть разделены на несколько групп (рис. 34). Прокариоты, для роста которых O2 необходим, называют облигатными (обязательными) аэробами. К ним относится большинство прокариотных организмов. Среди облигатных аэробов обнаружены существенные различия в отношении к уровню молекулярного кислорода в среде. Некоторые представители этой группы не способны к росту при концентрации O2, равной атмосферной, но могут расти, если содержание O2 в окружающей среде будет значительно ниже (порядка 2%). Такие облигатно аэробные прокариоты получили название микроаэрофилов.

Потребность прокариот в низкой концентрации O2 в окружающей среде связана с их метаболическими особенностями. Многие аэробные азотфиксирующие бактерии могут расти в среде с молекулярным азотом только при концентрации O2 ниже 2%, т. е. как микроаэрофилы, а в присутствии связанного азота, например аммонийного, — на воздухе. Это объясняется ингибирующим действием молекулярного кислорода на активность нитрогеназы — ферментного комплекса, ответственного за фиксацию Na. Аналогичная картина обнаружена у многих водородокисляющих бактерий. На среде с органическими соединениями в качестве источника энергии они хорошо растут при атмосферном содержании O2. Если источником энергии является окисление молекулярного водорода, эти же бактерии для роста требуют низкой концентрации O2. Последнее связывают с инактивацией молекулярным кислородом гидрогеназы — фермента, катализирующего использование H2.

Наконец, среди облигатных аэробов существуют значительные различия в устойчивости к высоким уровням O2 в среде. 100%-ный молекулярный кислород подавляет рост всех облигатных аэробов. Многие аэробные бактерии могут формировать колонии на поверхности твердой питательной среды в атмосфере, содержащей 40% O2, но рост их прекращается, когда содержание СO2 в атмосфере повышается до 50%.

Известны прокариоты, для метаболизма которых O2 не нужен, т. е. энергетические и конструктивные процессы у них происходят без участия молекулярного кислорода. Такие организмы получили название облигатных анаэробов. К ним относятся метанобразующие архебактерии, сульфатвосстанавливающие, маслянокислые и некоторые другие эубактерии. До сравнительно недавнего времени считали, что облигатные анаэробы могут получать энергию только в процессе брожения. В настоящее время известно много облигатно анаэробных прокариот, которые произошли от аэробов в результате вторичного приспособления к анаэробным условиям, приведшего к потере способности использовать O2 в качестве конечного акцептора электронов в процессе дыхания. Такие облигатные анаэробы получают энергию в процессах анаэробного дыхания, т. е. переноса электронов по цепи переносчиков на CO2, SO42 – , фумарат и другие акцепторы.

<<< НазадСодержаниеДальше >>>

medbookaide.ru