Гусев М. В., Минеева Л. А. - Микробиология

Итак, в соответствии с хемиосмотической теорией П. Митчелла, энергия, освобождаемая в результате работы; электронтранспортной цепи, первоначально накапливается в форме трансмембранного градиента ионов водорода. Разрядка образующегося DmH+ происходит с участием локализованного в той же мембране протонного АТФ-синтазного комплекса: Н+ возвращаются по градиенту DmH+ через Н+–АТФ-синтазу, при этом без возникновения каких-либо промежуточных высокоэнергетических соединений из АДФ и неорганического фосфата образуется АТФ. (Сами сопрягающие мембраны в интактном состоянии непроницаемы для ионов, особенно Н+ и ОН–.) Предположительно, для синтеза одной молекулы АТФ достаточен перенос двух протонов, т. е. Н+/АТФ=2. Однако не исключено, что Н+/АТФ может быть больше.

Локализованная в мембране H+–АТФ-синтаза катализирует реакции синтеза и гидролиза АТФ в соответствии с уравнением:

АДФ + ФН + nHНАР+ « АТФ + H2O + nHВНУТР+ Реакция, протекающая слева направо, сопряжена с транспортом H+ по градиенту DmH+, что приводит к его разрядке и синтезу АТФ. Протекающая в противоположном направлении реакция гидролиза АТФ, сопровождающаяся переносом Н+ против градиента, приводит к образованию (или возрастанию) DmH+ на мембране. Таким образом, АТФ-синтазный ферментный комплекс служит механизмом, обеспечивающим взаимное превращение двух форм клеточной энергии (DmH+ « АТФ), устройством, сопрягающим процессы окислительной природы с фосфорилированием.

Известно несколько реакций, генерирующих DmH+. У разных групп прокариот от 1 до 3 из них локализованы в дыхательной цепи. На 2 или 3 этапах DmH+ генерируется в темновых реакциях переноса электронов в фотосинтетической цепи. Образование DmH+ происходит при гидролизе АТФ в H+-зависимой АТФ-синтазной реакции. К числу устройств, генерирующих DmH+ посредством трансмембранного переноса H+, относится бактериородопсин галофильных архебактерий. У некоторых групп прокариот обнаружена локализованная в мембране неорганическая пирофосфатаза, катализирующая расщепление и синтез пирофосфата. Расщепление последнего приводит к генерированию DmH+. Наконец, источником DmH+ на ЦПМ прокариот могут быть процессы, связанные с выделением во внешнюю среду продуктов брожения, транспорт которых через мембрану происходит вместе с протонами.

Энергия в форме DmH+ может использоваться в различных энергозависимых процессах, локализованных на мембране. Синтез АТФ за счет DmH+ можно рассматривать как пример химической работы. С использованием энергии DmH+ могут осуществляться и другие виды химической работы в клетке: синтез пирофосфата, катализируемый связанным с мембраной ферментным комплексом; обратный перенос электронов, приводящий к восстановлению НАД(Ф)+.

Энергия в форме DmH+ используется для поглощения ДНК в процессе генетической трансформации и для переноса белков через мембрану. Движение многих прокариот обеспечивается энергией DmH+. Важная роль принадлежит DmH+ или одной из его составляющих в осуществлении процессов активного транспорта молекул и ионов через ЦПМ прокариот (рис. 26).

Все известные системы транспорта у прокариот можно разделить на два типа: первичные и вторичные. Разобранные выше примеры трансмембранного переноса H+ с участием окислительно-восстановительной "петли", бактериородопсина или в результате гидролиза АТФ, катализируемого H+—АТФ-синтазой, происходящие за счет химической энергии или электромагнитной энергии света, относятся к первичным транспортным системам (рис. 26, А). В результате их функционирования на мембране генерируется энергия в форме DmH+, которая в свою очередь может служить движущей силой, обеспечивающей с помощью индивидуальных белковых переносчиков поступление в клетку необходимых веществ разной химической природы и удаление из нее конечных продуктов метаболизма. Устройства, с помощью которых осуществляется трансмембранный перенос веществ по градиенту DmH+ или одной из его составляющих, относятся ко вторичным транспортным системам (рис. 26, Б).

Как известно, в случае пассивной диффузии вещества движущей силой служит только градиент его концентрации (Dm) вне и внутри клетки. Если подобный градиент существует и в процессе активного транспорта вещества, он может вносить определенный вклад в общую движущую силу процесса, однако этот вклад не является определяющим. В большинстве случаев перенос вещества по механизму активного транспорта происходит против концентрационного градиента этого вещества.

Вторичные транспортные системы могут быть также разделены на три группы. Перенос молекул вещества, не сопряженный с какими-либо встречными или сопутствующими перемещениями молекул других веществ, получил название унипорта. По механизму симпорта перенос молекул вещества сопряжен с переносом протонов в том же направлении и осуществляется при участии одного и того же белкового переносчика, В процессе антипорта перенос вещества сопряжен с переносом H+ в противоположном направлении. Поступление веществ в клетку по механизму симпорта и унипорта широко распространено у прокариот и служит для поглощения ими большинства необходимых органических и неорганических соединений.

Для понимания движущих сил, участвующих в активном транспорте разных типов молекул (электронейтральных, несущих положительный или отрицательный заряд), следует помнить, что в цитоплазме более щелочная среда и суммарный отрицательный заряд. Незаряженные молекулы (глюкоза, галактоза, нейтральные аминокислоты) переносятся в клетку вместе с протонами за счет обоих компонентов Dm — Dy и DpH

Молекулы, имеющие отрицательный заряд (глюконат, глутамат, H2PO4–), котранспортируются с H+ в электронейтральной форме за счет только DpH. Положительно заряженные молекулы и ионы переносятся через мембрану в цитоплазму по механизму унипорта с использованием в качестве движущей силы электрического компонента DmH+. Таким путем осуществляется перенос в клетку, например, ионов К+ или лизина. Примером антипортной системы может служить откачивание из цитоплазмы ионов Na+, происходящее в обмен на поступление в нее ионов H+. Движущей силой процесса является DpH.

Все это позволяет рассматривать энергию в форме DmH+ (наряду с АТФ) как широко используемую внутри клетки. Преобразование энергии в клетке прокариот схематически изображено на рис. 27. Как видно из этой схемы, АТФ и DmH+ можно считать двумя взаимопревращаемыми "энергетическими валютами" клетки, каждая из которых способна служить источником энергии для выполнения химической, осмотической, механической работ.

Для чего клетке необходимы две формы энергии?

АТФ участвует в реакциях, протекающих в цитоплазме, т е. в форме АТФ энергией обеспечиваются все процессы, протекающие в водной среде. К числу последних относится большинство биосинтетических реакций. Помимо этого АТФ служит источником энергии для протекания ряда мембранзависимых процессов.

Энергия протонного градиента связана исключительно с мембранами, которые являются н необходимым компонентом Для его образования. Поэтому энергией в форме DmH+ могут обеспечиваться только процессы, локализованные на мембране. Таким образом, у DmH+ более узкая область приложения. В то же время использование клеткой энергии в форме DmH+ имеет определенные преимущества: DmH+ в форме его электрической составляющей — более удобная форма энергии для внутри- и межклеточной транспортировки. Скорость переноса энергии посредством диффузии АТФ в цитоплазме значительно медленнее, чем скорость передачи Dy по мембранам. Диффузия АТФ может быть сильно затруднена в клетках с развитой системой внутрицитоплазматических мембран. Наконец, перенос энергии посредством диффузии АТФ совсем неэффективен, если речь идет о межклеточном транспорте энергии, что важно для многоклеточных организмов. В этом случае эффективность передачи энергии по мембранам наиболее очевидна. Энергия в форме DmH+ не содержится в виде определенных порций, как это имеет место в молекуле АТФ. При гидролизе макроэргической фосфатной связи АТФ освобождается определенное количество энергии (DG0'=–31,8 кДж/моль). Если для сопряженного эндергонического процесса требуется меньшее количество энергии, остальная часть рассеивается в виде тепла. При использовании энергии в форме трансмембранного потенциала потерь, обусловленных запасанием энергии в виде порций, не происходит. С этим связано и еще одно преимущество при использовании клеткой энергии в форме DmH+ не существует нижнего порога для его образования. Для синтеза АТФ необходима разность окислительно-восстановительных потенциалов порядка 200 мВ. Ниже этого порогового значения АТФ не может быть синтезирован. Для образования энергии в форме трансмембранного потенциала подобных ограничений нет. Поэтому энергия DmH+ может образовываться и потребляться клеткой в условиях, когда синтез АТФ невозможен.

Таким образом, хотя каждая форма клеточной энергии может быть использована для осуществление химической, механической и осмотической работы, между ними существует определенное "разделение труда", например, большинство биосинтезов обеспечивается энергией АТФ, активный транспорт — энергией DmH+. Из этого следует, что клетке необходимо всегда иметь определенное количество энергии в той и другой легко мобилизуемой форме. Это может быть одной из причин существования в клетке двух взаимосвязанных энергетических пулов (резервуаров), между которыми при необходимости легко может осуществляться перекачка энергии (рис. 27). Емкость обоих энергетических пулов невелика. Например, величина DmH+ поддерживается на уровне 200–250 мВ. Внутриклеточная концентрация АТФ составляет около 2 мМ. Это также указывает на каталитическую роль АТФ в клетке. Подсчитано, что для удвоения клеточной массы молекула АТФ должна около 10000 раз участвовать в реакциях гидролиза и синтеза.

Энергетические затраты клетки

В растущей бактериальной культуре потребление энергии в первую очередь связано с процессами биосинтеза веществ, из которых состоит клетка. Количество энергии, необходимое для биосинтетических целей, в большой степени зависит от состава среды культивирования. Теоретически рассчитано, что при выращивании культуры бактерий в среде с минеральными солями и глюкозой в качестве единственного источника углерода 1 моль АТФ затрачивается для синтеза 27 г вещества клеток. Если же единственным источником углерода служит СО2, тогда использование того же количества АТФ приведет к синтезу только 5 г вещества клеток.

Для Е. coli большая часть биосинтетических реакций в настоящее время известна. Это позволило определить количество АТФ, используемого для образования основных клеточных макромолекул. В культуре Е. coli, растущей в среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода, для синтеза 1 г клеточного материала расходуется около 37 ммоль АТФ. Больше половины этого количества (около 20 ммоль) используется в реакциях, ведущих к синтезу белковых молекул. Следующими по энергетическим затратам биосинтетическими процессами являются ферментативные пути синтеза РНК и ДНК (около 7 ммоль АТФ), а также реакции полимеризации моносахаров (около 2 ммоль АТФ).

Помимо энергетических затрат на биосинтетические процессы, связанные с ростом, определенная часть клеточной энергии всегда тратится на процессы, не связанные непосредственно с ростом. Последние получили название процессов поддержания жизнедеятельности. К специфическим функциям поддержания жизнедеятельности относятся: обновление клеточного материала, осмотическая работа, обеспечивающая поддержание концентрационных градиентов между клеткой и внешней средой, подвижность клетки и др. Энергию, расходующуюся на осуществление перечисленных функций, обозначают как энергию поддержания жизнедеятельности, Когда бактерии находятся в условиях, в которых у них по каким-либо причинам отсутствует рост и, следовательно, нет надобности в энергии для биосинтезов, у них и в этом случае не прекращаются определенные метаболические процессы. Примером крайнего проявления состояния покоя служат бактериальные эндоспоры, метаболическая активность которых находится на уровне, не всегда регистрируемом современными приборами. Однако и в этом случае она не равна нулю.

Здесь необходимо остановиться на одном принципиально важном моменте. Состояние покоя живых организмов — всегда динамическое, в отличие от статического состояния неживых систем. Это означает, что в покоящихся организмах концентрации большинства молекул поддерживаются не статически, а динамически, т. е. процессы распада органических соединений и компенсирующие их биосинтетические процессы продолжаются и в состоянии кажущегося покоя.

Активно обновляющимися клеточными веществами являются молекулы ферментных белков, иРНК, материал клеточных стенок и мембран. Динамическое состояние свойственно почти всем метаболитам и структурам клетки, различие наблюдается только в отношении скоростей процессов обновления различных клеточных компонентов. Исключение составляют молекулы ДНК и некоторых бактериальных белков. В отношении ДНК понятно, что динамическое состояние генетического материала повышает опасность возникновения ошибок при его обновлении и связанные с этим летальные последствия для организма.

В условиях активного роста энергия, используемая в процессах обновления, составляет лишь небольшую часть общих энергетических расходов клетки. В состоянии покоя общие энергетические затраты клетки значительно понижаются, и на этом фоне удельный вес расходуемой на обновление клеточных веществ энергии заметно возрастает. Значительная часть энергии поддержания жизнедеятельности расходуется на совершение осмотической работы. В приведенном выше расчете энергетических затрат E. coli для процессов активного транспорта используется примерно 5 ммоль АТФ.

Величина энергии поддержания жизнедеятельности в значительной степени зависит от условий роста. Так, для Azotobacter vinelandii, фиксирующего азот при низком (0,02 атм) и высоком (0,2 атм) уровне растворенного кислорода, она колеблется от 22 до 220 ммоль АТФ на 1 г биомассы, т. е. прямо пропорциональна концентрации растворенного O2. Клетка тратит много дополнительной энергии для защиты от избытка кислорода, ингибирующего ферментную систему, ответственную за фиксацию молекулярного азота. Энергия поддержания жизнедеятельности обычно составляет 10–20% всей энергии, расходуемой в энергозависимых процессах. Описаны, однако, условия, в которых бактерии расходуют на поддержание жизнедеятельности до 90%, вырабатываемой энергии.

Консервирование энергии

Энергетический метаболизм в целом сопряжен с биосинтетическими и другими энергозависимыми процессами, происходящими в клетке, для протекания которых он поставляет энергию, восстановитель и необходимые промежуточные метаболиты. Сопряженность двух типов клеточного метаболизма не исключает некоторого изменения их относительных масштабов в зависимости от конкретных условий. Прокариоты, обладающие наиболее совершенными системами получения энергии (дыхание, фотосинтез), способны генерировать энергию в значительно большем количестве, чем необходимо для. роста и обеспечения всех энергозависимых клеточных функций.

Возможны такие условия, когда клетка запасает энергии больше, чем тратит. В этом случае она сталкивается с проблемой консервирования энергии. В молекулах АТФ энергия не хранится в течение длительного времени. Средняя продолжительность "жизни" молекул АТФ составляет около 1/3 с. Энергия в форме DmH+ также не может накапливаться. Движение H+ против градиента возможно только до достижения определенного уровня, после которого возникшая разность концентраций и электрических зарядов будет тормозить поступление ионов водорода против градиента. Таким образом, в молекулах АТФ и в виде DmH+ энергия находится в мобильной форме, призванной обеспечивать все идущие в настоящий момент энергозависимые процессы.

Проблема консервирования энергии решена прокариотами путем синтеза восстановленных высокополимерных молекул, главным образом полисахаридов, реже липидов или полипептидов. Молекулы запасных веществ плотно упакованы в гранулах и часто окружены белковой оболочкой (см. табл. 5). В таком виде они находятся в осмотически неактивном состоянии, что очень важно для клетки.

Способы существования и типы жизни у прокариот

В зависимости от того, какой источник энергии могут использовать прокариоты, их делят на фототрофов (источник энергии — свет) и хемотрофов (источник энергии — окислительно-восстановительные реакции). Организмы, у которых источниками (донорами) электронов в энергетическом процессе являются неорганические вещества, предложено называть литотрофными, а те, у которых донорами электронов служат органические соединения, — органотрофными. Тогда в зависимости от источника энергии и природы донора электронов возможны четыре основных типа энергетического метаболизма: хемолитотрофия, хемоорганотрофия, фотолитотрофия и фотоорганотрофия.

У прокариот с хемотрофным типом энергетического метаболизма одно и то же соединение служит донором электронов, большая часть которых перемещается в соответствии с термодинамическим градиентом, что приводит к выделению свободной энергии, а меньшая — используется для образования восстановителя, потребляемого в конструктивном метаболизме. Это положение справедливо в отношении прокариот с энергетикой бродильного и дыхательного типов, при использовании в качестве энергетических ресурсов органических и неорганических соединений. У фототрофов использование света в качестве источника энергии требует дополнительного подключения химических соединений, служащих донорами электронов для образования восстановителя. Это связано со спецификой света как энергетического ресурса для живых систем.

Каждый тип энергетического метаболизма может осуществляться на базе различных биосинтетических способностей организма. Выше уже обсуждалось деление всех прокариот в зависимости от особенностей конструктивного метаболизма на две группы: авто- и гетеротрофов. Следовательно, можно выделить 8 сочетаний типов энергетического и конструктивного метаболизма, которые отражают возможности способов существования (питания) прокариот (табл. 12). Всем способам питания соответствуют реально существующие прокариотные организмы. Однако число видов прокариот, относящихся к группам, характеризующимся разными способами питания, далеко не одинаково. Подавляющее число прокариот сосредоточено в группе с хемоорганогетеротрофным типом питания. Такая же неравномерность в распределении по типам питания присуща и фотосинтезирующим прокариотам. Большинство (цианобактерии, пурпурные и зеленые серобактерии) относится к группе с фотолитоавтотрофным способом питания. Часто для характеристики способа питания прокариот пользуются более общими понятиями, чем приведенные в табл. 12, употребляя для этого сочетания только двух признаков: источник энергии (фото-, хемо-) + источник углерода для построения веществ тела (авто-, гетеро-).

Перечисленные в табл. 12 сочетания основных видов энергетического и конструктивного метаболизма характеризуют все возможные способы питания прокариотных организмов. Некоторые прокариоты могут существовать только на базе одного какого- нибудь способа питания. Например, одноклеточная цианобактерия Synechococcus elongatus может использовать в качестве источника энергии только свет, а как основной источник углерода в конструктивном метаболизме — углекислоту. Характеризуя способ существования (образ жизни, тип метаболизма) этого организма, мы говорим, что он облигатный фотолитоавтотроф. Многие бактерии, относящиеся к роду Thiobacillus, — облигатные хемолитоавтотрофы, т. е. источником энергии для них служат процессы окисления различных соединений серы, а источником углерода для построения веществ тела, — углерод углекислоты. Подавляющее большинство бактерий — облигатные хемоорганогетеротрофы, использующие в качестве источника углерода и энергии органические соединения.